趙大力,韓中波,周亞麗

(1.長(zhǎng)春國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心,吉林長(zhǎng)春 130062;2.吉林市結(jié)核病防治研究所,吉林吉林 132011）

結(jié)核病是嚴(yán)重危及全球的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一,高耐藥性結(jié)核病的流行,成為結(jié)核病診斷和治療的難點(diǎn)。結(jié)核菌的培養(yǎng)和藥敏結(jié)果,在結(jié)核病的防治中起著重要作用[1]。目前公認(rèn)的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)方法有兩種,一是液體培養(yǎng)基快速檢測(cè)法,其營(yíng)養(yǎng)成分高,培養(yǎng)速度快,一般僅需10-20天,藥敏僅需10天。缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴,不能客觀觀察結(jié)果,需特殊儀器(設(shè)備與培養(yǎng)基均需進(jìn)口）,其次是藥敏試驗(yàn)種類少。二是改良羅氏培養(yǎng)法,是我國(guó)普及通用的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)方法,為固相培養(yǎng)方法,是利用自制培養(yǎng)基在直視觀察下,結(jié)核桿菌的菌落生長(zhǎng)情況。其優(yōu)點(diǎn)是藥敏試驗(yàn)種類廣泛,可以選擇出敏感藥物,以指導(dǎo)臨床化療方案的制定、價(jià)格低廉,但缺點(diǎn)是時(shí)間長(zhǎng),培養(yǎng)需6-8周,藥敏時(shí)間一般又需4周。我們針對(duì)性地開(kāi)展二者優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)作用的探討,研究結(jié)核分枝桿菌固液雙向培養(yǎng)基。

1 材料和方法

1.1 7H9液相培養(yǎng)基的制備7H9干粉培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)sigma公司 ,取干粉2.35 g,蒸餾水溶解后加入2 ml甘油,蒸餾水補(bǔ)足至450 ml,高壓滅菌、待冷卻后 ,按 50 μ g/ml加入羥芐青霉素 、10 μ g/ml加入兩性霉素B,營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑(OADC）50 ml混勻,置 4℃冰箱備用。

1.2 液體PNB培養(yǎng)基配制取0.5 gPNB加無(wú)菌蒸餾水10 ml溶解后,加90 ml 7H9液體培養(yǎng)基內(nèi),分裝中號(hào)試管,置4℃冰箱備用。

1.3 固液雙相培養(yǎng)基的配制接種菌株前制備,以改良羅氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ),加入7H9液相培養(yǎng)基4 ml(約占斜面的一半）。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株及菌懸液的制備用接種環(huán)挑取菌落若干,于含有2滴 0.5%Tween80生理鹽水試管內(nèi),用圓頭玻棒,在試管底部研磨成糊狀,用生理鹽水將菌液稀釋成1 mg/ml菌懸液,再用生理鹽水作梯度稀釋,H37Rv制成為10-1-10-8mg/ml各種不同濃度菌懸液。其他分枝桿菌制成10-3mg/ml菌懸液備用。

1.5 基礎(chǔ)試驗(yàn)將雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶打開(kāi),取上述菌懸液0.2 ml,分別接種在兩種不同(改良羅氏和固液雙相）的培養(yǎng)基上,各接種2組。置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng),1周內(nèi)每天觀察一次結(jié)果,記錄結(jié)核桿菌在兩種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。

1.6 臨床標(biāo)本試驗(yàn)取本院結(jié)核科患者晨痰1份.于無(wú)菌試管內(nèi),加2%氫氧化鈉2-4倍,用吸管充分混勻后置37%溫箱30 min(其間混勻2次）使之完全液化。取液化后試管內(nèi)中層痰液0.2 ml,分別接種于固液雙相培養(yǎng)基、羅氏培養(yǎng)基和PNB培養(yǎng)基,每份2瓶,置37℃溫箱培養(yǎng),每周記錄陽(yáng)性數(shù)和污染數(shù)至8周為止,并記錄每份標(biāo)本的初期生長(zhǎng)時(shí)間。PNB培養(yǎng)基不生長(zhǎng)者為人型或牛型結(jié)核桿菌。

1.7 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)改良羅氏培養(yǎng)基藥敏實(shí)驗(yàn)按常規(guī)絕對(duì)濃度法操作,藥物濃度分別為INH(1、10 μ g/ml）、SM(10 、100 μ g/ml）、RFP(50 、250 μ g/ml）、EMB(5、50 μ g/ml）,固液雙相培養(yǎng)基藥敏實(shí)驗(yàn) ,將藥物加到液體培養(yǎng)基中,藥物終濃度為INH(0.2 μ g/ml）、SM(2 μ g/ml）、RFP(1 μ g/ml）、EMB(4 μ g/ml）。并記錄每份標(biāo)本的初期生長(zhǎng)時(shí)間,對(duì)各種藥物的耐藥情況。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核桿菌在固液雙相培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的情況H37Rv 10-1mg/ml菌液在接種后第3天液相培養(yǎng)基中段略變混濁,有5-8個(gè)白色顆粒狀菌落出現(xiàn)。第5天即有15-20個(gè)菌落,8天時(shí)中段呈乳白狀混濁,轉(zhuǎn)動(dòng)試管可見(jiàn)無(wú)數(shù)菌落。固相在第6天出現(xiàn)明顯小菌落,第9天布滿斜面。菌落略粗糙,與改良羅氏培養(yǎng)基上菌落相同。將液相和固相菌落挑出分別涂片抗酸染色,均呈典型抗酸桿菌,但前者有索狀形成,后者菌體稍短。

2.2 臨床標(biāo)本分離培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 臨床標(biāo)本分離培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩種培養(yǎng)基的污染率無(wú)顯著性差異(P＞0.05）

2.3 固液雙相培養(yǎng)基和改良羅氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度的比較,結(jié)果見(jiàn)表2。固液雙相培養(yǎng)基的固相培養(yǎng)基結(jié)核菌生長(zhǎng)稍晚于液相培養(yǎng)基,但優(yōu)于羅氏培養(yǎng)基。

表2 固液雙相培養(yǎng)基和改良羅氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)速度的比較

結(jié)核分枝桿菌在固液雙相培養(yǎng)基平均生長(zhǎng)時(shí)間14.4天,改良羅氏培養(yǎng)23.5天,前者平均生長(zhǎng)快9.1天,二者有顯著性差異(P＜0.01）。

2.4 結(jié)核分枝桿菌在兩種培養(yǎng)基上的藥敏情況對(duì)比分析見(jiàn)表3。應(yīng)用固液雙相培養(yǎng)基進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),報(bào)告的平均天數(shù)為11.7天,改良羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行藥敏平均為20.5天,提前了8.8天。

表3 兩種方法測(cè)定103例結(jié)核分枝桿菌藥敏結(jié)果對(duì)比分析

兩種培養(yǎng)基上的藥敏情況,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各種藥物均無(wú)顯著性差異(p＞0.05）。

2.5 幾種培養(yǎng)基價(jià)格的對(duì)比分析(藥敏按四種藥物計(jì)算）見(jiàn)表4。

表4 幾種培養(yǎng)基價(jià)格的對(duì)比

由表4可看出:應(yīng)用固液雙相培養(yǎng)基進(jìn)行結(jié)核菌培養(yǎng)、藥敏所需的成本與改良羅氏培養(yǎng)基相當(dāng),確遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于液體培養(yǎng)基的價(jià)格。

3 討論

結(jié)核桿菌在雞蛋或含血清瓊脂等固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢的關(guān)鍵、是標(biāo)本經(jīng)酸或堿處理直接接種在培養(yǎng)基上后,至少需2-3天培養(yǎng)基才能緩沖堿,達(dá)到pH7.2左右。此外細(xì)菌細(xì)胞不能有效地吸收營(yíng)養(yǎng)成分而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延滯,而本研究設(shè)計(jì)固液雙相培養(yǎng)基pH為6.5-6.7接種氫氧化鈉與痰的混合液后,使pH改變至7.0-7.2。尤其是細(xì)菌細(xì)胞在液相培養(yǎng)基內(nèi)可使細(xì)菌浸泡在營(yíng)養(yǎng)成分中以利于新陳代謝對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期提前。本研究基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證明,說(shuō)明固液雙相培養(yǎng)基的優(yōu)越性。液體培養(yǎng)基陽(yáng)性菌落呈白色顆粒狀,難以鑒別菌落特性,而固相生長(zhǎng)的菌落則典型,易于判斷,且有利于藥敏試驗(yàn)菌落的挑選。雙相培養(yǎng)基液相部分可達(dá)到快速培養(yǎng)的目的,固相可提供分枝桿菌典型菌落,體現(xiàn)了雙相培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)[2]。從臨床陽(yáng)性標(biāo)本結(jié)果顯示雙相培養(yǎng)基平均生長(zhǎng)時(shí)間比羅氏培養(yǎng)基快8.1天左右,尤其是雙相培養(yǎng)基生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)間在30天.而傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)基規(guī)定為8周,所以使用雙相培養(yǎng)基可使結(jié)核培養(yǎng)縮短1個(gè)月。

本研究雙相培養(yǎng)基用磷酸鹽調(diào)節(jié)pH6.5-6.7,痰標(biāo)本經(jīng)2%氫氧化鈉處理后不中和、不離心直接接種,操作十分簡(jiǎn)便,且固相培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落典型,易于挑取,有利于藥敏實(shí)驗(yàn)菌懸液的定量制作。其污染率與改良羅氏培養(yǎng)基的污染率無(wú)無(wú)顯著性差異,在改良羅氏培養(yǎng)基中,微量孔雀綠既可抑制雜菌的生長(zhǎng),又可對(duì)結(jié)核桿菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。在Middle brook 7H9的基礎(chǔ)上,羧芐青霉素C、兩性霉素B即可制備成結(jié)核菌素的選擇培養(yǎng)基,其目的主要是為了減少污染率,提高陽(yáng)性率。

菌型鑒定采用PNB固液雙相培養(yǎng)基,在10天內(nèi)可達(dá)到初步篩選結(jié)核分枝桿菌的目的。

在藥敏方面,傳統(tǒng)的含藥羅氏培養(yǎng)基上存在抗結(jié)核藥物受熱失活和蛋白質(zhì)吸附兩個(gè)主要問(wèn)題至今尚未解決,而固液雙相培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)在于不存在高蛋白組分對(duì)藥物的吸附作用,又無(wú)加熱凝固等造成藥物失活問(wèn)題,因此在藥敏試驗(yàn)方面有著顯著的優(yōu)越性。本實(shí)驗(yàn)表明固液雙相培養(yǎng)基的藥敏結(jié)果與改良羅氏培養(yǎng)基無(wú)顯著性差異。藥敏試驗(yàn)報(bào)告結(jié)果比羅氏培養(yǎng)基平均早8.8天,多數(shù)藥敏結(jié)果可在2周內(nèi)報(bào)告,對(duì)結(jié)核病的臨床治療有重要指導(dǎo)意義。

本研究結(jié)果證明固液雙相培養(yǎng)基有刺激結(jié)核桿菌生長(zhǎng)的作用,尤其是其價(jià)格低廉,制作方便,操作簡(jiǎn)單,適合于我國(guó)廣大基層醫(yī)院和結(jié)核病院應(yīng)用,并有很高的應(yīng)用價(jià)值。

[1]申建維,袁 瑋,李 娉,等.平菇雙相培養(yǎng)基用于結(jié)核桿菌培養(yǎng)的研究[J].中國(guó)防癆雜志,2001,23(4）:241.

[2]匡鐵吉,董 梅,張青霞,等.匡氏瓊脂培養(yǎng)基用于痰結(jié)核菌直接藥敏試驗(yàn)的效果研究[J].中國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2002,3(2）:54.