周 媛,任美英

(解放軍208醫(yī)院 1.婦產(chǎn)科;2.急診科,吉林 長春 130062）

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF）是指女性在40歲以前因卵巢內(nèi)卵泡耗竭或因醫(yī)源性損傷而引起的以閉經(jīng)、不育、雌激素缺乏及促性腺激素水平升高為特征的一種疾病。卵巢早衰約占原發(fā)性閉經(jīng)患者的10%-28%,占繼發(fā)性閉經(jīng)患者的4%-18%,平均發(fā)病年齡為23.3歲,是婦科內(nèi)分泌領域的常見病[1]。多囊卵巢綜合征(syndrome of polycystic PCOS）是一種生殖功能障礙和糖代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂綜合征。持續(xù)性無排卵、雄激素水平過高和胰島素抵抗是其重要特征,是生育期婦女月經(jīng)紊亂最常見的病因[2]。此二疾病均有復雜的病理生理過程,月經(jīng)紊亂方式前者為閉經(jīng),后者為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng),這方面臨床表現(xiàn)有一定相似之處。前者卵巢以卵泡耗竭為特征,而后者卵巢多呈現(xiàn)多囊性改變。目前此二疾病的病因仍未被確切認知。但諸多學者公認這兩種疾病均為病因復雜的多基因疾病。已有研究證實bcl-2基因的表達情況對鼠類卵巢顆粒細胞凋亡起決定性作用[3],而卵泡閉鎖實際是與卵巢顆粒細胞及卵母細胞的凋亡有一定相關(guān)性的。研究發(fā)現(xiàn)bcl-2基因-838位點存在C/A多態(tài)性,這種基因多態(tài)性的存在很可能導致bcl-2基因轉(zhuǎn)錄和表達水平出現(xiàn)個體差異,從而影響bcl-2的生物學水平及其作用。因此,進行該位點基因多態(tài)性研究對認識遺傳因素的卵巢相關(guān)性疾病的發(fā)病具有重要意義。將有望為在基因水平預防、診斷、治療卵巢疾病提供必要的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 研究對象卵巢早衰組:2003年2月至2010年1月就診于解放軍208醫(yī)院婦產(chǎn)科門診的患者中,經(jīng)B超及女性激素6項檢查定診為卵巢早衰的患者68人,年齡30.83±6.13歲。多囊卵巢綜合征組:同期就診于解放軍208醫(yī)院經(jīng)B超、女性激素6項、血糖檢查診斷為多囊卵巢綜合征的患者113人,年齡31.02±6.98歲。健康成年女性組為同期門診體檢的成年女性,平均年齡30.78±6.31歲。以上實驗對象血常規(guī)、血脂及血離子指標均在正常范圍內(nèi),心電圖常規(guī)檢查正常,排除肝臟、腎臟和心血管疾病。全部實驗對象均為漢族,且相互間無血緣關(guān)系。

1.2 模板DNA的制備所有實驗對象均采集空腹肘靜脈血4 ml,用EDTA-K2抗凝,采用已建立的碘化鈉裂解、氯仿及戊醇提取法[4]提取白細胞基因組DNA,-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物合成參照文獻[5]設計合成一對引物(上海生工有限公司合成）,擴增bcl-2基因啟動子區(qū)的一段 DNA 序列。上游引物:5′-CTGCCTTCATTTATCCAGCA-3′,下游 引物:5′-GGCGGCAGATGAATTACAA-3′。

1.4 擴增條件PCR反應體系為25 μ l,其中模板DNA100 ng,10×PCR緩沖液2.5 μ l,Taq酶(德國QIAGEN公司產(chǎn)品）2.5 U,10 mmol/L三磷酸脫氧核苷(dNTPs）0.5 μ l,5 μ mol/L 上 、下游引物各 1 μ l。PCR反應條件為:96℃預變性5 min,然后96℃45 s變性,56℃40 s退火,72℃30 s延伸,35個循環(huán)后,72℃后續(xù)處理10 min。4℃保存。

1.5 擴增產(chǎn)物的限制性酶切取PCR擴增產(chǎn)物10 μ l,用10 U BccⅠ于37℃酶切12 h。反應終止后,產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,染色后以DL 200 DNA片段長度標準物為參考,在紫外燈下判斷結(jié)果,并拍照。

1.6 統(tǒng)計學處理用基因直接計數(shù)法計算健康人群bcl-2基因啟動子的基因型及等位基因頻率,不同人群間基因型及等位基因頻率用 χ2檢驗,均在SPSS13.0軟件包上完成。以P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 bcl-2基因型分析bcl-2基因-838C/A多態(tài)性,PCR擴增產(chǎn)物片段大小為300 bp,根據(jù)限制性內(nèi)切酶BccⅠ酶切片段的情況,基因型有3種,CC型(189 bp,111 bp,2條帶）,CA型(300 bp,189 bp,111 bp 3條帶）,AA型(300 bp 1條帶）通過以上條帶性況可直觀判斷出基因型。

2.2 各組人群bcl-2基因-838C/A攜帶頻率比較bcl-2基因-838C/A在卵巢早衰組與多囊卵巢綜合征組及健康成年女性組的分布頻率差異有顯著性(P＜0.05）,而多囊卵巢綜合征組及健康成年女性組無顯著性差異,見表1。

表1 各組人群間bcl-2基因-838C/A攜帶頻率分布

3 討論

不同的基因背景可以造成某些疾病不同的易感性,自上世紀未人類基因組計劃實施以來對于人類基因多態(tài)性與某些疾病之間關(guān)系的研究已成為必然。其已漸成為解釋某種疾病在不同人群中有著不同發(fā)病率、臨床表現(xiàn)、治療反應及預后的內(nèi)在機制。

bcl-2基因是目前研究較廣泛的一種細胞凋亡信號基因,人bc1-2是1984年由Tsujimoto等從與濾泡性淋巴細胞瘤相關(guān)的t(14;18）染色體易位的斷裂點克隆到的一種癌基因。bc1-2基因結(jié)構(gòu)包括3個外顯子和2個內(nèi)含子,第2、第3個外顯子有編碼功能,即使在t(14;18）轉(zhuǎn)位后其編碼功能也不受影響。bc1-2編碼的蛋白質(zhì)bc1-2蛋白由239個氨基酸殘基組成,分子量為26kD。bcl-2基因在進化過程中有高度保守的傾向,其蛋白功能也相對保守,從原生動物到人類細胞bcl-2蛋白都有抑制細胞凋亡的功能。bcl-2蛋白表達于正常細胞的激活和發(fā)育過程中,在成熟組織中亦有表達,在走向凋亡的細胞中低表達或不表達。bcl-2蛋白存在于免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等正常組織中,也存在于人體多種類型的腫瘤組織及胚胎組織中。檢測bcl-2產(chǎn)物在人體各類細胞中的表達顯示,壽命長的細胞中bcl-2的表達含量也高[6]。在正常細胞,bcl-2對抑制細胞凋亡、延長細胞壽命起著重要的作用。

bcl-2可防止或延遲由輻射、糖皮質(zhì)激素、熱休克和多種化療藥物所誘導的細胞凋亡,其不僅存在于B細胞淋巴瘤中,也存在于許多正常組織和胚胎組織中。在正常細胞,bcl-2對抑制細胞凋亡、延長細胞壽命起著重要的作用。bcl-2基因?qū)τ诼雅菁毎蛲龅恼{(diào)控也具有很重要的作用。有研究者曾做動物實驗證明顆粒細胞凋亡導致卵泡閉鎖時,在顆粒細胞內(nèi)幾乎檢測不到凋亡抑制基因的表達產(chǎn)物bc1-2蛋白[7]?？梢?bcl-2蛋白在抑制卵泡顆粒細胞及卵母細胞的凋亡中同樣起著重要的作用。

bcl-2基因在進化過程中無論是基因本身還是基因所編碼的蛋白質(zhì)都呈現(xiàn)出相對保守的趨勢,此基因的-838位點正位于基因調(diào)控區(qū),調(diào)控區(qū)任何一個位點變異都可能使基因表達調(diào)控有很大的改變。此基因位點CC-CA-AA的變異可能改變基因調(diào)控,使bcl-2表達減少,而這種蛋白的減少可以使原本存在的bc1-2蛋白對卵細胞凋亡的抑制作用消失,從面使卵細胞凋亡加速,當然這只是一種可能性。

多囊卵巢綜合征的發(fā)病與bcl-2基因-838位點的多態(tài)性無關(guān)并不代表遺傳因素在此病的發(fā)病中不起作用。事實上經(jīng)長期研究發(fā)現(xiàn),作為一種婦科最常見的良性疾病,多囊卵巢綜合征的表現(xiàn)極其復雜,可表現(xiàn)為經(jīng)月經(jīng)周期在35天以上的月經(jīng)稀發(fā)[8]和/或閉經(jīng),以及B超顯示任一卵巢內(nèi)直徑2-9 mm的卵泡≥12個,或卵巢體積＞10 ml[9]等等。多囊卵巢綜合征是一種卵巢性激素及促性腺激素依賴性疾病。其發(fā)生是一個多步驟的過程,主要與體內(nèi)的各種內(nèi)分泌激素之間的相互復雜作用有關(guān)。研究性腺軸的基因多態(tài)性變化如何影響多囊卵巢綜合征臨床特征及疾病易感性是目前的研究熱點[10],盡管各國做了有意義的嘗試,但仍未得出肯定結(jié)論。

本實驗結(jié)果表明bcl-2基因-838位點的多態(tài)性分布與卵巢早衰的發(fā)病具有一定程度的相關(guān)性,而與多囊卵巢綜合征的發(fā)病無相關(guān)性。當然卵巢早衰的病因和發(fā)病機理也較為復雜,也就是說bcl-2基因不可能是其唯一的致病基因。

從基因角度來研究卵巢早衰及多囊卵巢綜合征的各種發(fā)病因素將會為此二病病在基因水平預防、診斷及治療提供必要的基礎資料。而bcl-2基因做為卵巢早衰這種疾病的重要候選基因?qū)⒗^續(xù)是這方面研究的熱點。

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