張照紅,姚嵩梅,何成彥,張耀中

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林長春 130033）

大腸癌是當(dāng)前嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤。全世界每年大約有100萬大腸癌新發(fā)例,49.2萬人死于大腸癌[1]。近年來,大腸癌的診斷及綜合治療水平取得了很大的進(jìn)展,但其發(fā)病率和死亡率并未發(fā)生根本性的變化,因此大腸癌復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制需要繼續(xù)不斷的研究。腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來發(fā)展起來的新興科學(xué),隨著技術(shù)的不同完善,在臨床研究中越受青睞,應(yīng)用越來越廣。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中的重要方法二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)探討Dukes B期大腸癌與癌旁正常組織的蛋白質(zhì)的差異性,為進(jìn)一步研究大腸癌的病因、機(jī)制、轉(zhuǎn)移及治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集吉林大學(xué)第三醫(yī)院18例手術(shù)治療的大腸癌患者的腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為Dukes B期及各患者距離腫瘤組織邊緣10 cm以外的上端癌旁組織標(biāo)本,術(shù)前均經(jīng)患者同意?；颊咝g(shù)前未接受任何治療,年齡49-78歲,中位年齡57歲,其中男13人,女5人。將所獲得的新鮮標(biāo)本離體后用生理鹽水沖洗干凈后,放入液氮冷凍,-80℃保存。

1.2 主要試劑

Bio-Rad公司的碘代乙酰胺(IAA）、尿素(Urea）、硫脲(Thiourea）、三羥甲基氨基甲烷(Tris base）、3-[(3-膽酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS）、碳酸氫氨、苯甲基磺酰氟(PMSF）、Sigma公司的DNA酶和RNA酶、超純水、安捷倫公司的1200納升級液相色譜分析儀和賽默飛世爾公司的LTQXL離子肼質(zhì)譜儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1）組織總蛋白質(zhì)的提取及蛋白濃度分析:對組織標(biāo)本進(jìn)行研磨,裂解,低溫勻漿,離心,將蛋白上清液吸出備用,使用核酸蛋白分析儀檢測后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線分析計(jì)算蛋白濃度,分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2）組織蛋白水解多肽混合物的制備:將提取保存的組織蛋白室溫融化,用25 mM NH4HCO3稀釋,使尿素濃度低于2M,加入1 M的DTT,充分混勻,使其終濃度為20mM,56℃下還原1 h后降至室溫加入1M的碘乙酰胺混勻使其終濃度為50 mM,常溫下避光反應(yīng)30 min,按1∶50加入測序級胰酶37℃酶切過夜,酶切后樣品真空抽干后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3）二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析與數(shù)據(jù)庫檢索:將所有樣品用緩沖液A溶解,,各取50 μ g樣本上樣經(jīng)反相色譜洗脫的多肽應(yīng)用LTQ XL質(zhì)譜儀檢測,核質(zhì)比檢測范圍為400-2 000 amu,應(yīng)用數(shù)據(jù)依賴方式進(jìn)行次二級質(zhì)譜掃描。

(4）強(qiáng)度在10個單位以上、有10個以上離子信號的譜圖用SEQUEST算法和Bioworks 3.3.1 SP1軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索,鑒定出相關(guān)多肽和蛋白。SEQUEST檢索后篩選參數(shù)如下:1、Rsp= 1;2、在假陽性率為1%時,DeltaCn≥0.19,Xcorr值在單電荷時為2.2,雙電荷時為2.5,三電荷為2.9。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織總蛋白酶解混合物的二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果

腫瘤組織制備的蛋白水解多肽混合物進(jìn)行二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析,得到腫瘤組織酶解混合物的多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù),總共鑒定出860個蛋白質(zhì)。

2.2 癌旁組織總蛋白的二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果

癌旁組織制備的蛋白水解多肽混合物進(jìn)行二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析,得到癌旁組織酶解混合物的多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù),總共鑒定出549個蛋白質(zhì)。

2.3 腫瘤組織與癌旁組織差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

應(yīng)用每個蛋白質(zhì)的譜圖數(shù)來評價其豐度。對于在不同樣本中豐度發(fā)生變化的蛋白,其譜圖數(shù)變化必須滿足一下原則:1、兩個樣本中譜圖數(shù)的比值大于等于 1;2、兩個樣本中譜圖數(shù)的差值大于等于72(平均每次實(shí)驗(yàn)差值為24）。為評價上述方法用于鑒定蛋白豐度變化的假陽性率,每個樣本進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn),然后將結(jié)果相互比較分析,相應(yīng)假陽性率為2.13%。將腫瘤組織與癌旁組織的蛋白質(zhì)組分析的結(jié)果進(jìn)行對比共得到23個蛋白在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào),見表1。

表1 二維色譜與質(zhì)譜鑒定的有顯著差異的腫瘤組織下調(diào)蛋白

3 討論

細(xì)絲蛋白A(Filamin-A,FLNa）

FLNa屬于肌動性結(jié)合蛋白(actin binding protein,ABP）,參與細(xì)胞骨架的形成,與細(xì)胞的增殖、粘附、遷徙、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)[2]。FLNa基因結(jié)構(gòu)高度保守,表達(dá)廣泛,對哺乳動物的生長發(fā)育具有重要作用。FLNa包含A、B、C 3個亞型,每個亞型相對分子質(zhì)量為280×103,長度約為80 nm。FLN a分子包含N末端的肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,4-24個串聯(lián)的重復(fù)序列形成的棒狀結(jié)構(gòu)域及由大約30個氨基酸殘基形成的2個鉸鏈區(qū)域。每個重復(fù)序列均由96個氨基酸形成多個反向平行的免疫球蛋白樣的β片層結(jié)構(gòu),其中第9-15個重復(fù)序列含有與肌動蛋白高親和性結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)域,第16-24個重復(fù)序列含有一個與配體相結(jié)合的位點(diǎn),第24個重復(fù)序列末端相連形成與其功能有關(guān)的“V”同源二聚體結(jié)構(gòu),因而具有良好的韌性,并且機(jī)械性信號桿部的重復(fù)序列和鉸鏈區(qū)域而進(jìn)行傳遞[3]。FLNa主要分布在細(xì)胞質(zhì),具有多種功能,N末端的肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域能與ABP結(jié)合,可交聯(lián)肌動蛋白形成穩(wěn)固的細(xì)胞骨架,與細(xì)胞運(yùn)動有關(guān);多重β片層結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用提供了平臺,能夠與多種具有重要功能的蛋白質(zhì)相互作用;其與組織因子相互作用,促進(jìn)血管重塑和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[4];因此,FLNa分子作為一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)支架蛋白參與細(xì)胞增殖、黏附、侵襲等多種行為[5]。此外,FLNa還與其他ABP一起影響多種受體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),干預(yù)多條與腫瘤形成有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要[6]。

本研究用免疫組織化學(xué)和Western blot技術(shù)對直腸癌組織及正常直腸組織進(jìn)行定位及定量檢測,結(jié)果顯示FLN a蛋白、mRNA在直腸癌組織中的表達(dá)水平均顯著低于正常直腸組織,取得了一致結(jié)果。Bedolla等使用免疫組織化學(xué)法檢測了不同進(jìn)展階段的前列腺癌組織標(biāo)本FLNa蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)與良性前列腺、前列腺上皮內(nèi)瘤和原位癌的FLNa蛋白表達(dá)相比,轉(zhuǎn)移性前列腺癌FLNa蛋白細(xì)胞質(zhì)內(nèi)FLNa表達(dá)明顯減少,而細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯增多,并認(rèn)為這可能與癌細(xì)胞惡性程度增加有關(guān)。這些結(jié)果還難以解釋,可能是由于FLNa對不同部位、不同病理類型的瘤細(xì)胞存在著不同的作用,其機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)癌組織的FLNa蛋白表達(dá)低于正常組,說明FLNa蛋白可抑制結(jié)直腸腺癌的發(fā)生,在病理狀態(tài)下呈低表達(dá),同時FLNa蛋白的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲力呈負(fù)相關(guān),對結(jié)直腸腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移具有阻遏作用,有望成為結(jié)直腸腺癌預(yù)后判斷的新指標(biāo)。

Transgelin(膠轉(zhuǎn)蛋白）

Transgelin又稱SM-22 alpha是一種主要在脊椎動物平滑肌中表達(dá)的保守蛋白[7-8],分子量為22 kD,1987年LESS-MILLER在雞胃中首先發(fā)現(xiàn)。人類Transgelin基因定位于染色體11q 23.2上,其cDNA含有1 214 bp和200個氨基酸序列的閱讀框[11]。膠轉(zhuǎn)蛋白是一種肌動蛋白壓力纖維素相關(guān)的蛋白質(zhì)[13],與凝膠劑起反應(yīng)并能穩(wěn)定體外的肌動蛋白凝膠劑。它還與平滑肌中的激動蛋白絲有相關(guān)性[14]。

很多研究已經(jīng)證明膠轉(zhuǎn)蛋白可能存在抑制腫瘤的作用。細(xì)胞骨架肌動蛋白纖維的分解是癌癥細(xì)胞表型發(fā)展的一個基本證據(jù)。一些蛋白質(zhì)結(jié)合肌動蛋白后形成交聯(lián),增加蛋白絲的硬性,防止其出現(xiàn)去極化,并使蛋白絲凝結(jié)為應(yīng)力纖維。正如RNA和DNA病毒的永生狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄一樣,含TGB-β的細(xì)胞孵化的延長減少了應(yīng)力纖維的形成,阻礙了細(xì)胞的移動,并抑制了膠轉(zhuǎn)蛋白的表達(dá)[15]。研究報道用差異篩選技術(shù)分離正常膀胱組織和膀胱癌組織中差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)Transgelin基因在正常膀胱組織中高表達(dá),在膀胱癌中表達(dá)下調(diào),可能反映了腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞黏附、細(xì)胞間相互作用、遷移及運(yùn)動等諸多過程中的異常,可能與癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),大腸癌標(biāo)本與正常大腸黏膜比較Transgelin的表達(dá)明顯下調(diào),其中Transgelin的DNA甲基化起重要作用,同時Transgelin表達(dá)量低的患者與表達(dá)量高的患者比較預(yù)后較差[16]。Shiel DS[17]的研究發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系及腫瘤標(biāo)本中Transgelin基因均降調(diào)節(jié),這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。這些研究證實(shí)Transgelin基因的表達(dá)缺失有可能是腫瘤進(jìn)展過程中的早期事件。Transgelin基因可能是一種新的抑癌基因,可能會對這些常見癌癥介入治療的發(fā)展提供一定的目標(biāo)。但亦有研究表明Transgelin蛋白在胃癌和食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)。因此,Transgelin基因在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用還有待進(jìn)一步研究。

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