楊 鴻，周春喜，李晶哲，馬琰巖，于友華，喻曉春，林 謙，逯金金

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078;3.美國布魯克公司北京技術(shù)支持中心，北京 100081)

近年來，發(fā)展迅速的蛋白指紋圖譜技術(shù)由于其高靈敏性和高特異性，克服了以雙向電泳、多維液相色譜為核心的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在重復(fù)性、高通量等方面存在的缺陷，有望成為今后探索中醫(yī)證候本質(zhì)的新研究方法;但在該技術(shù)應(yīng)用過程中仍有許多問題需要進(jìn)一步解決，如證候樣本的收集和預(yù)處理方式、蛋白分離提取方法、實驗體系的穩(wěn)定性和重復(fù)性等因素都會影響實驗分析的結(jié)果，最終都需要通過標(biāo)準(zhǔn)化處理來加以解決。本文以慢性心衰氣陰虛證為研究對象，通過應(yīng)用磁珠法結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術(shù)分析慢性心衰氣陰虛病人血液蛋白和多肽組分，探索和完善中醫(yī)證候蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的樣品收集及預(yù)處理、分離制備、檢測等方法，為有效獲取中醫(yī)證候血液蛋白及多肽圖譜，深入分析中醫(yī)證候物質(zhì)基礎(chǔ)確定可行的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

慢性心衰氣陰虛證(依據(jù)《指南》標(biāo)準(zhǔn)，慢性心衰C期(既往或目前有心衰癥狀)患者，依據(jù)慢性心衰中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷有氣陰虛證的患者。年齡30歲～70歲)，18例來自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，18例對照血樣來自健康志愿者(年齡30歲～70歲)。

1.2 血液樣品收集與預(yù)處理

采用EDTA-K3抗凝管、聚丙烯干燥管采集患者治療前或健康志愿者外周血各4ml，室溫靜置1h，4℃ 3000r/min離心10min，分離血漿、血清分裝于500μl EP管中，凍存于－80°C備用。使用前取出血液樣品，冰上融化。

1.3 儀器與試劑

EDTA-K3一次性真空采血管及血清真空采血管，奧地利格雷那公司;銅螯合(IMAC-Cu)磁珠試劑盒，弱陽離子(WCX)磁珠試劑盒，標(biāo)準(zhǔn)品(preptide和 protein混合物)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)，德國Bruker Daltonics公司產(chǎn)品;三氟乙酸(TFA)、乙腈(ACN)，美國 Sigma公司產(chǎn)品;Allegra 25R低溫離心機(jī)，美國 BECKMAN產(chǎn)品;Autoflex Ш MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀，德國 Bruker公司產(chǎn)品。

1.4 血液蛋白及多肽提取方法

按照IMAC-Cu和WCX磁珠試劑盒說明書要求，將CHF氣陰虛證和健康對照組血清與血漿樣品進(jìn)行分別處理，將洗脫下來的多肽樣品溶液移入干凈的0.5ml樣品管，以備質(zhì)譜檢測。

1.5 質(zhì)譜檢測方法

在MALDI靶面上先點1μl洗脫樣品，室溫放干后再點 1μl基質(zhì)(3mg/ml CHCA，50%ACN，2%TFA)，室溫放干。放入 AutoflexⅢ MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜檢測，條件如下:SmartBeam TM激光源，波長355 nm，正離子模式，掃描相對分子質(zhì)量范圍1000～10000，激光能量36%，每個樣品疊加1000張譜圖。

1.6 生物信息學(xué)處理

質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過 FlexAnalysis 3.0進(jìn)行基線的平滑、去背景、標(biāo)峰處理，再通過ClinProTools軟件進(jìn)行峰面積歸一化和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1對磁珠結(jié)合質(zhì)譜檢測血液蛋白多肽方法的重復(fù)性觀察

表1顯示，對經(jīng)過WCX磁珠提取處理的同一慢性心衰氣陰虛證患者血漿樣品進(jìn)行了8個時間點的檢測，選擇高、中、低分子量3個范圍內(nèi)的10個峰，以質(zhì)譜峰下面積為強(qiáng)度，計算變異系數(shù)進(jìn)行重復(fù)性評估。樣品變異系數(shù)范圍在6.65% ～20.62%，重復(fù)性較好。

2.2 不同樣品與基質(zhì)配比對質(zhì)譜結(jié)果的影響

選擇慢性心衰氣陰虛證患者經(jīng)過WCX磁珠提取的血漿樣本與質(zhì)譜基質(zhì)按照 0.2/1、0.4/1、0.6/1、0.8/1、1/1 5種配比比例，分別檢測獲得樣品基質(zhì)不同配比的質(zhì)譜圖。結(jié)果顯示，在適當(dāng)范圍內(nèi)改變樣品與基質(zhì)比例對結(jié)果無影響。

2.3 反復(fù)凍融對血液多肽的影響

取慢性心衰患者的同一血漿樣本反復(fù)凍融5次，分別進(jìn)行IMAC-Cu磁珠提取后檢測多肽的質(zhì)譜圖。實驗結(jié)果顯示，無論在出峰數(shù)量還是峰的強(qiáng)度等方面，反復(fù)凍融5次之內(nèi)沒有顯著差異。

表1 血漿質(zhì)譜檢測的重復(fù)性考察

2.4 血液不同采集方式和提取方法質(zhì)譜差異比較

表2顯示，分別檢測慢性心衰氣陰虛證組和健康對照組經(jīng)IMAC-Cu、WCX磁珠處理的血漿組、血清組樣品，分析血液不同采集方法和不同磁珠試劑盒提取的血液多肽質(zhì)譜差異。結(jié)果顯示，慢性心衰氣陰虛證組和健康對照組在相應(yīng)檢測范圍內(nèi)，經(jīng)IMAC-Cu磁珠提取后獲得的血清質(zhì)譜峰分別為65、68個，而血漿則為39、32個;經(jīng)WCX提取后獲得的血清質(zhì)譜峰分別為75、82個，而血漿則為47、79個。結(jié)果顯示，無論是患者還是健康志愿者，不同磁珠處理方法得到的血清樣品的平均質(zhì)譜峰數(shù)量均多于血漿的質(zhì)譜峰數(shù)量;而不同血液處理方法中，WCX磁珠提取血液多肽獲得的質(zhì)譜峰情況多于IMAC-Cu磁珠處理方法。

表2 不同血液處理和磁珠提取方法的質(zhì)譜出峰情況

2.5 慢性心衰氣陰虛證與健康對照組間血液多肽質(zhì)譜圖初步比較

圖1顯示，對于相同血液處理和磁珠提取的慢性心衰氣陰虛證組和健康對照組間血液多肽比較顯示，2組間質(zhì)譜峰數(shù)量接近，但其血液蛋白質(zhì)譜有明顯差異，如IMAC-Cu提取的患者組與健康對照組的血清質(zhì)譜二維分布圖中，質(zhì)荷比為7766Da的質(zhì)譜峰在2組樣品中的峰強(qiáng)度有明顯差異;初步分析后顯示，根據(jù)差異表達(dá)蛋白可以很好區(qū)分2組間差異。

3 討論

圖1 IMAC-Cu磁珠提取的患者與健康志愿者血清/血漿二維分布圖

近年來，不少中醫(yī)藥工作者利用雙向電泳、液相色譜等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行了中醫(yī)證候的探索研究［1、2］，然而由于這些技術(shù)在重復(fù)性、靈敏性、高通量等方面仍有很多問題，影響了其在臨床中的應(yīng)用與推廣。最近幾年來研究發(fā)現(xiàn)，基于磁珠提取的MALDI-TOF-MS技術(shù)在發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物、識別復(fù)雜反應(yīng)的蛋白質(zhì)組指紋圖譜方面成效顯著［3-7］，是目前蛋白質(zhì)組研究中發(fā)展最快、最具活力和潛力的質(zhì)譜研究技術(shù)之一，具有高通量、高精確、能夠進(jìn)行快速分離、制備和鑒定的特性，非常適于中醫(yī)證候體系的復(fù)雜蛋白質(zhì)表達(dá)模式獲得以及比較分析。本實驗建立了磁珠法結(jié)合 MALDI-TOF MS進(jìn)行慢性心衰氣陰虛證血液蛋白質(zhì)組學(xué)研究的實驗方法，為中醫(yī)證候蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了新技術(shù)參考。

首先，重復(fù)性研究顯示，采用峰面積作為相對強(qiáng)度得到的樣品變異系數(shù)范圍在6.65% ～20.62%之間，根據(jù)以往文獻(xiàn)［8-11］報道的11% ～30%、3% ～33%，在可接受范圍內(nèi)，說明重復(fù)性較好。在進(jìn)行血液樣品的前處理時，反復(fù)凍融5次之內(nèi)，無論在出峰數(shù)量還是峰的強(qiáng)度等方面，質(zhì)譜出峰情況沒有顯著差異。但由于反復(fù)多次凍融血液樣品易造成蛋白質(zhì)及多肽沉淀，從而導(dǎo)致質(zhì)譜丟失部分蛋白及多肽，因此盡量避免反復(fù)凍融不超過3次為宜。

在質(zhì)譜分析過程中，樣品與基質(zhì)的比例對質(zhì)譜信號有很大影響。本研究顯示，血漿樣本與基質(zhì)選擇 0.2/1、0.4/1、0.6/1、0.8/1、1/1 5 種配比比例，質(zhì)譜圖未見差異，因此在適當(dāng)范圍內(nèi)改變樣品與基質(zhì)比例對結(jié)果無影響。

本研究顯示，基于不同的血液處理方法，血漿和血清的蛋白質(zhì)譜圖存在很大的差異:兩種磁珠提取方法獲得的血清質(zhì)譜信號數(shù)量均高于血漿，這與凝血過程涉及激肽、補(bǔ)體、多種因子的釋放等有關(guān);目前大多數(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究采用的是血清標(biāo)本，但越來越多的學(xué)者主張為反映機(jī)體體內(nèi)的實際情況最好采用血漿，只有在抗凝劑干擾檢驗結(jié)果的情況下，才考慮采用血清［12-14］。當(dāng)前仍沒有足夠的證據(jù)支持蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)該選擇血漿或是血清作為研究材料，因此在研究中若將血清和血漿進(jìn)行平行對比和印證分析，可以增加結(jié)論的可靠性。

在蛋白質(zhì)分離提純中，具有不同的化學(xué)和生物學(xué)表面修飾的磁珠能被不同的蛋白質(zhì)識別和可逆結(jié)合，選用哪種磁珠進(jìn)行分離對研究結(jié)果的影響也很大。我們的實驗結(jié)果顯示，通過弱陽離子磁珠提取獲得的血液質(zhì)譜信號要多于銅螯合磁珠，表明弱陽離子磁珠可以從樣品中篩選出更多的蛋白質(zhì)，為尋找到CHF氣陰虛證差異蛋白質(zhì)提供了更大的可能性。具體研究中可以根據(jù)實驗研究目的的不同，如為了分離盡可能多的蛋白還是僅僅分離樣品中某些感興趣的蛋白，來選擇合適的磁珠試劑進(jìn)行提取。

磁珠結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)檢測血液蛋白及多肽譜的整個實驗體系穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，適用于中醫(yī)證候蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

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