金光明，鄭壽煥

（延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000）

CD14是革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分——脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的受體，主要表達(dá)在單核巨噬細(xì)胞表面，它可通過脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccha-ride binding protein，LBS）與 LPS 特異性結(jié)合，并通過Toll樣受體-4以及MD2蛋白向下游傳遞活化信號，啟動單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（mononuclearphagocyte system，MPS），并釋放多種細(xì)胞因子，通過促進(jìn)基底膜增厚、增加細(xì)胞外基質(zhì)和加劇腎小球的硬化[1-3]等多種途徑引起糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）的發(fā)生。而 CD14啟動子-159存在（C-T）的基因多態(tài)性，可以直接造成蛋白質(zhì)生物學(xué)性狀的改變。為了探討CD14啟動子-159的（C-T）多態(tài)性對延邊地區(qū)朝鮮族DN患者發(fā)病的影響，筆者開展了本研究。

1 材料與方法

1.1 對象

隨機(jī)選取本院接待的朝鮮族健康體檢者139名：男性99名、女性40名，平均年齡（60.5±9.7）歲作為正常對照組，臨床和實驗室檢查均正常，排除肝、腎、內(nèi)分泌和心腦血管疾?。贿x取2005年12月～2009年12月在本院內(nèi)分泌科住院的朝鮮族DN患者152例：男性83例、女性69例，平均年齡（55.3±6.8）歲。DN的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：尿白蛋白排泄率（Urinary albumin excretion rate，UAER）＞20μg/min的糖尿病患者。兩組在年齡和性別間的比較差異無顯著性。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用Promega公司生產(chǎn)的WizardRGenomicDNA Purification Kit提取DNA。取被檢測對象肘靜脈血3 mL到加有EDTA-Na2抗凝劑的真空采血管中，并立刻顛倒混勻。取300μL血樣加入到1.5 mL Eppendorf離心管中，按照細(xì)胞裂解、核裂解、RNA去除、沉淀蛋白質(zhì)、析出DNA、清洗DNA和水化DNA的過程分別加入試劑，進(jìn)行DNA的提取。最后將所得的DNA經(jīng)紫外分光光度計定量后于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng) 所設(shè)計引物為：上游引物：5'-GCCTCTGACAGTTTATGTAATC-3'，下游引物：5'-GTGCCA ACAGATGAGGTTCAC-3'，由Promega公司合成。CD14的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系均為50μL，其中含 10×PCR緩沖液 5μL，2.5 mmol/L dNTP 5μL，上、下游引物各 1μL，模板 DNA 5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，不足體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50μL。置熱循環(huán)儀（TC-48/H型）中94℃預(yù)變性5 min；再按下列程序循環(huán)35次，即94℃變性60 s，57℃退火 45 s，72℃延伸 1 min；末次循環(huán)后，72℃延伸10 min。利用MegaBACE1000全自動毛細(xì)血管測序儀，由北京華美基因提供測序服務(wù)。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，用5 u限制性內(nèi)切酶 AvaⅡ（Promega公司）酶切CD14基因-159位點，37℃孵育2 h，反應(yīng)終止后，消化片段在2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，染色后經(jīng)紫外燈判斷結(jié)果并拍照。

1.2.4 DN患者各項生化指標(biāo)的測定 所有參與者記錄姓名、性別、年齡、病程、血壓，并計算體重指數(shù)（body mass indes，BMI）。BMI= 體重（kg）/身高的平方（m2）。限制高脂肪、高蛋白飲食24 h。于次日清晨用強(qiáng)生SureStep Plus血糖儀檢測空腹血糖及餐后2 h血糖；空腹抽取肘靜脈血，一支分離血清用酶法測定生化指標(biāo)：三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、 低 密 度 脂 蛋 白（low-density lipoprotein-cholestero，LDL-C）、血肌酐（creatinine，Cr）、C 反應(yīng)蛋白 （C reaction protein，CRP），以上生化指標(biāo)利用我院日立7600-101全自動生化分析儀檢測（酶法）；另一支采用EDTA-Na2抗凝，0.5 mL采用微柱法測定糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，GHb）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行分析。計數(shù)資料如基因型和等位基因頻率采用直接計數(shù)法，各組間基因型及等位基因的頻率比較采用四格表χ2檢驗，確定各基因型和等位基因頻率已達(dá)Hardy-Weinberg平衡，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間數(shù)據(jù)的比較依據(jù)資料的性質(zhì)，采用t檢驗或方差分析。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律檢驗，CD14啟動子-159（C-T）基因型的分布符合遺傳平衡定律，符合等位基因頻率在不同種族人群中的分布。

2.1 CD14基因型分析

CD14 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為497 bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶AvaⅡ酶切片段的情況，基因型有3種，CC型（497 bp 1條帶），CT型（497、353和144 bp 3條帶），TT型（353和144 bp 2條帶）（見圖1）；測序結(jié)果表明該位點存在C-T的基因多態(tài)性（見圖2）。

圖1 CD14啟動子-159位點基因型的5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 CD14啟動子-159位點基因型測序圖

2.2 正常朝鮮族對照組與朝鮮族DN組CD14基因多態(tài)性的比較

CD14啟動子-159位點的基因多態(tài)性在朝鮮族正常對照組和朝鮮族DN患者中的分布差異無顯著性（χ2=1.776，P＞0.05）；等位基因頻率在兩組人群中的分布也差異無顯著性（χ2=0.309，P＞0.05）（見表 1）。

表1 正常朝鮮族對照組和朝鮮族DN組CD14啟動子-159位點各基因型和等位基因頻率分布 例（%）

2.3 朝鮮族男性與朝鮮族女性DN患者基因多態(tài)性分布的比較

表2 朝鮮族男性和女性DN患者CD14啟動子-159位點CC基因型和CT+TT基因型分布比較 例（%）

將朝鮮族男性與朝鮮族女性DN患者中CD14啟動子-159位點純合子CC的基因頻率與雜合子CT及純合子TT基因頻率相比，發(fā)現(xiàn)差異存在顯著性（χ2=3.903，P＜0.05）（見表 2）。

2.4 對照組與DN患者各項臨床指標(biāo)的比較

兩組之間病程、FBG、CRP和LDL-C比較，結(jié)果差異呈現(xiàn)顯著性（P＜0.05或P＜0.01），與年齡、PBG、GHb、Cr、TC、TG、HDL-C 和 BMI無關(guān)（均P＞0.05）（見表 3）。

表3 正常對照組和DN患者臨床生化指標(biāo) （±s）

表3 正常對照組和DN患者臨床生化指標(biāo) （±s）

組別例數(shù)/n年齡/歲病程/年FBG/（mmol/L）PBG/（mmol/L）GHb/%Cr/（mmol/L）正常組 139 55.32±0.82 4.83±0.35 13.14±0.55 17.40±0.64 9.17±0.19 67.82±2.80 DN 152 54.37±1.23 10.46±0.771） 11.35±0.521） 17.66±0.83 10.67±1.02 105.37±10.13

續(xù)表3

3 討論

目前國內(nèi)多采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)研究CD14基因啟動子-159位點的基因多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)，不同人群和種族間CD14基因啟動子-159位點基因多態(tài)性的CC基因頻率分布有一定差異。在歐洲白種人中，希臘人CC基因頻率最高（0.430）[4]，意大利人最低（0.270）[5]。亞洲人群如中國人、印度人和日本人之間CD14基因啟動子-159位點的基因頻率分布十分接近，但均與歐美和非洲國家人群之間存在明顯差異。我國北方地區(qū)漢族人CC的基因頻率明顯低于德國人[6]、挪威人[7]、希臘人、捷克人[8]、以色列人[9]和意大利人。

本研究檢測結(jié)果表明，CC基因的相對頻率在朝鮮族對照組和朝鮮族DN組中分別為0.230和0.224，兩組CD14基因啟動子-159位點（C-T）基因多態(tài)性基因型和等位基因的頻率分布無明顯差異。CC基因的相對頻率在朝鮮族男性和朝鮮族女性的DN患者中分別為0.319和0.181，兩者之間存在明顯差異。DN組的病程、FBG、CRP和LDL-C均高于對照組，提示以上因素在DN的發(fā)生中起一定的作用。

近年來，一些研究[10-11]表明，CD14啟動子上游C-159T基因的多態(tài)性與冠心病、腦卒中等血管病變的發(fā)生關(guān)系密切，且這種相關(guān)性與種族相關(guān)，但有關(guān)CD14啟動子-159位點（C-T）基因的多態(tài)性與糖尿病引起的微血管病變的報道仍然很少。本研究分析了139例朝鮮族健康對照組與152例朝鮮族DN患者CD14啟動子-159位點（C-T）基因的多態(tài)性特點及其在延邊地區(qū)朝鮮族中男性與女性之間的分布差異，結(jié)果示朝鮮族DN組中男性CC基因的頻率明顯高于女性，提示該等位基因可能與朝鮮族男性DN的發(fā)生有關(guān)。綜上所述，可以初步得出：CD14啟動子-159位點（C-T）基因的多態(tài)性雖然不是我區(qū)朝鮮族DN發(fā)生的主要遺傳標(biāo)志，但可能是朝鮮族男性DN患者發(fā)病的易感基因。

隨著人類基因組計劃的發(fā)展，人們已經(jīng)認(rèn)識到不同的基因背景可以造成不同人群對于某些疾病存在不同的易感性。研究不同基因型在人群中的分布，有助于從基因水平更深刻地闡明各種疾病在不同種族和不同性別人群中存在不同發(fā)病率和不同臨床表現(xiàn)的內(nèi)在機(jī)制。目前有關(guān)CD14啟動子-159位點（C-T）基因的多態(tài)性與糖尿病血管并發(fā)癥關(guān)聯(lián)的研究已成為各個國家研究的熱點，但是，不同群體所得到的關(guān)聯(lián)程度也不一致。本研究結(jié)果證實CD14啟動子-159位點（C-T）基因的變異在延邊地區(qū)朝鮮族發(fā)病的男性中較高。不同基因變異在不同群體關(guān)聯(lián)程度不一致的原因可能有以下幾點：①不同的遺傳背景和環(huán)境背景導(dǎo)致了不同群體和民族關(guān)聯(lián)表現(xiàn)的不同；②不同研究者對于選擇的患者采用的角度不同，如從糖尿病、冠心病、腦梗死等不同角度的研究；③當(dāng)樣本含量較小時，將實驗所得出的肯定性結(jié)論應(yīng)用于臨床上時，其信息仍顯不足[12]。

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