鐘 萍 ，王云甫 ，李 萍

（湖北醫(yī)藥學院 1.醫(yī)療保健中心；2.第一臨床學院，湖北 十堰 442000）

云芝多糖（Coriolus versciclor polysaccharides，CVP）具有多種生物活性，可提高抗氧化酶活性、清除自由基以及對氧化應激有抑制和拮抗作用[1-2]；各種原因的肝損傷與氧化應激密切相關，但CVP對免疫性肝損傷保護作用及機制的研究尚無資料報道，本文以卡介苗（BCG）和脂多糖（LPS）制備免疫性肝損傷模型[3]，研究CVP抗實驗性肝損傷的作用及機制，為拓展CVP的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 物藥品及試劑

4月齡昆明種小鼠50只，雌雄性各半分籠飼養(yǎng)，由本院動物中心提供。丙二醛（MDA）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、腫瘤壞死因子（TNF-a）一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）購自南京建成生物工程研究所；云芝多糖（CVP）購自神華藥業(yè)有限公司；脂多糖（LPS）美國Sigma公司產(chǎn)品；卡介苗（BCG），上海生物制品研究所。其余為國產(chǎn)分析純生化試劑。

1.2 儀器設備

ZS83-1型內(nèi)切式組織勻漿機（浙西機械廠），722S型分光光度計（上海第二光學儀器廠），酶標儀（熱電上海儀器公司），RA-50半自動生化分析儀（美國Technicon公司）

1.3 方法

50只小鼠隨機分為5組，每組10只，分空白對照組；病理模型組；云芝多糖保護組分高、中、低3組。造模第1天，除正常對照組外，其余各組小鼠經(jīng)尾靜脈注射2.5 mg BCG；云芝多糖低、中、高保護組每天分別按體重（100、200和300 mg/kg）云芝多糖灌胃1次，對照組和模型組用生理鹽水同樣處理，第12天用云芝多糖灌胃給藥2 h后，模型組和云芝多糖各保護組從尾靜脈注射7.5μg/只LPS。末次給藥禁食不禁水16 h后，稱取小鼠體重，眼球取血分離血清，測定ALT和AST。然后處死小鼠立即取出肝臟、胸腺稱重，計算肝體指數(shù)（肝重/體重）、胸腺指數(shù)（胸腺重/體重×100%）；肝臟稱重剪碎，用冰PBS按1∶10稀釋冰浴下勻漿，4 000 r/min離心5 min，取上清液用雙縮脲法測肝勻漿中蛋白質(zhì)含量，用PBS稀釋成4 mg/mL蛋白，按試劑盒要求檢測肝勻漿中 MDA、GSH、NO和 TNF-α 的含量和 SOD、GSH-Px和NOS的活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果

2.1 云芝多糖對免疫性肝損傷小鼠肝體指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

免疫性肝損傷模型組肝體指數(shù)、胸腺指數(shù)，與空白對照組和CVP各保護組比較，肝損傷模型組各臟器指數(shù)存在明顯差異，說明建立模型是成功的。CVP各保護組可降低免疫性肝損傷小鼠肝體指數(shù)和胸腺指數(shù)，與模型組比較（P＜0.05）。結果見表1。

表1 云芝多糖對免疫性肝損傷肝體指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響 （±s）

表1 云芝多糖對免疫性肝損傷肝體指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響 （±s）

注：1）與模型組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.01

分組n肝體指數(shù)/（肝重/體重）胸腺指數(shù)/（胸腺重/體重×100%）空白對照組 10 0.0388±0.00352） 0.263±0.1501）病理模型組 10 0.0531±0.0048 0.158±0.0381 100 mg CVP保護組 10 0.0482±0.00521） 0.448±0.2042）200 mg CVP保護組 10 0.0491±0.00371） 0.972±0.3902）300 mg CVP保護組 10 0.0513±0.0011 0.991±0.3292）

2.2 云芝多糖對免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性和肝臟MDA含量的影響

免疫性肝損傷模型組小鼠血清ALT和AST活性和MDA的含量顯著升高，與對照組比較（P＜0.01），說明制備免疫性肝損傷模型是成功的。ALT和AST是分別反應肝細胞膜損傷和線粒體膜損傷的重要指標，CVP各保護組可降低小鼠血清中ALT和AST的活性，但保護作用與CVP濃度有關，與模型組比較（P＜0.05）。CVP保護組MDA明顯降低，與模型組比較（P＜0.01）。結果見表2。

表2 云芝多糖對小鼠免疫性肝損傷血清ALT、AST活性和肝臟MDA含量的影響 （±s）

表2 云芝多糖對小鼠免疫性肝損傷血清ALT、AST活性和肝臟MDA含量的影響 （±s）

注：1）與模型組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.01

分組 n ALT活性/（u/L）AST活性/（u/L）MDA/（nmol/mg pro）空白對照組 10 27.5±14.852） 43.5±9.052） 5.01±0.562）病理模型組 10253.12±100.64147.62±50.84 6.26±0.87 100 mg CVP保護組 10 201.42±98.52 111.5±30.71 4.89±1.732）200 mg CVP 保護組 10122.75±74.072） 71.52±26.662） 4.26±1.682）300 mg CVP 保護組 10160.05±99.851） 86.49±32.011） 4.36±1.642）

2.3 云芝多糖對免疫性肝損傷小鼠SOD、GSH-Px活性及GSH含量的影響

免疫性肝損傷病理模型組SOD活性與空白對照組比較明顯降低（P＜0.05），與CVP各保護組比較無明顯差異；CVP各保護組可提高GSH-Px活性，與病理模型組比較（P＜0.01）；免疫性肝損傷模型組GSH含量明顯降低，不同濃度的CVP保護組可增加GSH的含量，與模型組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），結果見表 3。

表3 云芝多糖免疫性肝損傷肝損傷SOD、GSH-Px活性及GSH含量的影響 （±s）

表3 云芝多糖免疫性肝損傷肝損傷SOD、GSH-Px活性及GSH含量的影響 （±s）

注：1）與模型組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.01

分組 n SOD/（u/mg.prot）mg GSH·g·pro空白對照組 10 366.73±34.981） 496.47±6.672） 42.58±1.571）病理模型組 10 337.12±31.097 128.68±81.07 39.78±1.71 100 mg CVP 保護組 10 325.28±41.62 456.52±11.082） 45.83±2.232）200 mg CVP 保護組 10 332.25±21.77 478.96±18.192） 45.36±1.412）300 mg CVP 保護組 10 347.82±31.65 490.91±15.422） 46.97±1.782）GSH-Px/（u/mg.prot）

2.4 云芝多糖對免疫性肝損傷小鼠NOS活性，NO及TNF-α含量的影響

免疫性肝損傷小鼠模型組NOS活性、NO和TNF-α含量與各組比較明顯升高，對照組NOS活性與模型組比較降低，但無統(tǒng)計學意義，而NO及TNF-α含量明顯降低與模型組比較（P＜0.05）。CVP各保護組可降低NOS活性及NO和TNF-α含量，與模型組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結果見表4。

表4 云芝多糖對免疫性肝損傷小鼠NOS活性，NO及TNF-α含量的影響 （±s）

表4 云芝多糖對免疫性肝損傷小鼠NOS活性，NO及TNF-α含量的影響 （±s）

注：1）與模型組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.01

分組 n NOS/（u/mg·prot）TNF-α/（pg/mL）空白對照組 10 2.33±0.273 5.25±0.981） 295.5±37.161）病理模型組 10 2.778±0.474 7.86±0.82 323.82±21.99 100 mgCVP 保護組 10 1.852±0.2412） 6.12±0.791） 235.4±53.262）200 mg CVP 保護組 10 1.826±0.3532） 4.28±0.862） 236.89±54.822）300 mg CVP 保護組 10 1.751±0.3862） 4.93±1.032） 201.58±55.992）NO/（μmol/g·prot）

3 討論

BCG與LPS被廣泛應用于免疫性肝損傷的實驗研究模型，BCG首先激活致敏T淋巴細胞，尤其是致敏肝內(nèi)Kupffer細胞和巨噬細胞大量聚集于肝臟，當注射LPS攻擊，使致敏狀態(tài)的細胞釋放大量炎性介質(zhì)，如TNF-α、白細胞介素、NO和自由基等[4-5]，其損傷機制類似于臨床病毒性肝炎的病理生理過程，是篩選保肝藥物的理想模型之一。本研究病理模型組肝體指數(shù)增大、胸腺指數(shù)變小，血清ALT、AST活性升高，肝臟MDA、NO、TNF-α含量和NOS活性增加；GSH含量及GSH-Px活性降低，證明BCG與LPS致小鼠免疫性肝損傷模型是成功的。其機制是BCG和LPS所致免疫性肝損傷分泌炎性因子使肝細胞出現(xiàn)炎性浸潤，導致肝細胞腫脹引起肝體指數(shù)增大，胸腺指數(shù)變小，不同濃度的云芝多糖保護組能降低小鼠肝體指數(shù)、增加胸腺指數(shù)；與模型組比較（P＜0.05），說明多糖云芝能抑制炎性介質(zhì)的分泌。

免疫性肝損傷產(chǎn)生的自由基攻擊膜磷脂中的不飽和脂肪酸而損傷肝細胞膜和線粒體膜，導致膜通透性增加致使ALT、AST逸出，引起血清ALT、AST升高；不同濃度的云芝多糖保護組能降低小鼠血清ALT、AST活性與模型組比較（P＜0.05），但降低 ALT和AST活性與多糖濃度存在量效關系[6]。MDA是自由基代謝的終產(chǎn)物其含量可反映肝細胞損傷程度，不同濃度的云芝山藥多糖保護組能降低小鼠肝臟MDA的含量，與模型組比較（P＜0.01）。表明云芝多糖對小鼠免疫性肝損傷具有對抗和清除自由基作用。

GSH是生物體內(nèi)重要的還原物質(zhì)，可作為GSH-Px等的輔酶參與清除自由基，同時GSH也具有直接清自由基的作用[7]。免疫性肝損傷時加速模型組GSH的消耗，導致GSH明顯降低，不同濃度的云芝多糖保護組能升高GSH的含量，與模型組比較（P＜0.01），說明云芝多糖能直接清除自由基，或者是通過促進谷胱甘肽合成酶的合成，增加GSH的含量。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶，其作用機制是SOD催化2分子氧自基生成O2和H2O2；GSH-Px的作用是由GSH提供原當量催化H2O2或過氧化物（ROOH）生成水，從而清除自由基。本研究病理模型組與云芝多糖保護組SOD活性無明顯差異，與對照組比較明顯降低（P＜0.05），說明BCG+LPS所致免疫性肝損傷可加速SOD的消耗。但多糖云芝保護組能提高GSH-Px活性，與模型組比較（P＜0.01），說明免疫性肝損傷可加速GSH-Px的消耗，云芝多糖可通過提高GSH-Px活性清除自由基。

而肝內(nèi)一氧化氮合酶主要為內(nèi)皮型（eNOS）和誘導型（iNOS），iNOS主要分布在肝Kupffer細胞及肝內(nèi)皮細胞，正常情況下不表達，在內(nèi)毒素和炎性因子刺激下iNOS可催化L-精氨酸生成NO。NO和TNF-α在免疫性肝損傷中起到重要作用；NO對肝細胞具有雙重作用，既有保護功能又有殺傷毒性與促進炎癥的雙重作用，生理濃度的NO對肝臟有保護作用；高濃度的NO可抑制肝細胞蛋白質(zhì)的合成和損傷DNA結構；直接抑制線粒體呼吸，使肝細胞內(nèi)能量代謝障礙而引起肝細胞凋亡和壞死[8]，TNF-α是引起急慢性肝損傷的重因素之一，TNF-α本身具有細胞毒性作用，能激活T、B淋巴細胞，增加自然殺傷細胞的殺傷能力，直接或間接引起肝細胞的免疫性肝損傷。還可誘導TNF-α本身、L-1和L-6等細胞因子的分泌，介導肝細胞功能受損而加重肝損傷[8-9]。免疫性肝損傷模型組NOS活性及NO和TNF-α的含量明顯升高，不同濃度的云芝多糖保護組能降低NOS活性及NO、TNF-α的含量，與模型組比較P＜0.01。實驗表明，CVP可通過抑制免疫性肝損傷的炎性浸潤，降低肝體指數(shù)及血清中ALT和AST的活性；提高GSH-Px活性和GSH的含量，降低NOS活性，降低MDA、NO和TNF-α的含量，對免疫性肝損傷有較強的保護作用。

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