張小敏， 張博愛(ài)， 賈 賀， 劉 宇， 劉榮麗， 姬亞杰， 李 星

慢性腦缺血是一種常見(jiàn)的病理狀態(tài)。慢性腦缺血或腦灌注不足伴發(fā)于腦動(dòng)脈硬化、血管性癡呆、Alzheimer病、Binswanger病和動(dòng)靜脈畸形等多種腦血管疾病的病理過(guò)程中，發(fā)病早期以認(rèn)知功能損害為主要表現(xiàn)，最終可能導(dǎo)致持久或進(jìn)展性認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙［1］。雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎(2VO)大鼠慢性期的神經(jīng)病理改變與人類老齡化和AD時(shí)慢性腦低灌注很相似，被廣泛用來(lái)研究慢性腦缺血注對(duì)認(rèn)知功能損害和神經(jīng)變性疾病的影響［2］。海馬和前額皮質(zhì)區(qū)(PFC)均與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，在慢性腦缺血所致認(rèn)知障礙中，有關(guān)海馬的病理改變研究很多，但關(guān)于PFC的相關(guān)報(bào)道卻少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)利用高爾基染色對(duì)2VO大鼠模型前額皮質(zhì)區(qū)(mPFC)錐體細(xì)胞樹(shù)突長(zhǎng)度、分枝及樹(shù)突棘密度等形態(tài)分析，從而探討慢性腦缺血與錐體細(xì)胞形態(tài)變化的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型建立

采用7月齡SD大鼠(不分雌雄)40只為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供。將40只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為手術(shù)組和假手術(shù)組，每組20只。手術(shù)組采用永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎(2VO)法［3］制備腦供血不足模型，假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，余處理同模型組大鼠。標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，大鼠生活環(huán)境為20℃ ±2℃，濕度為60±10℃，通風(fēng)良好，照明隨同自然變化。(手術(shù)組存活15只，假手術(shù)組存活18只)。

1.2 取材與制片

分別于大鼠飼養(yǎng)2w、4w及8w，各組抽取5只SD大鼠。將其麻醉后，采用灌注的快速Golgi法［4］處理，方法如下:10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔注射麻醉，待翻正反射消失后，仰臥位，固定四肢，剖開(kāi)腹腔，暴露肝臟。之后，迅速剪開(kāi)橫膈膜、打開(kāi)胸腔，暴露心臟。用37℃ 0.5%亞硝酸鈉的生理鹽水進(jìn)行灌注，待流出的液體無(wú)血色，遂將灌注液換成10%福爾馬林生理鹽水溶液繼續(xù)灌注。灌注固定液充分后，略候1～2h。又用媒染液(由水合氯醛、重鉻酸鉀、濃甲醛及蒸餾水配制成)灌注，至流出液顯濃厚桔紅色，再略等1～2h。開(kāi)顱取腦組織。組織塊厚約5～10mm，仍用媒染液浸泡，置暗處避光于室溫3d。用1%硝酸銀水溶液浸泡鍍銀，置暗處3d。每日換新銀液1次，瓶底加棉紗墊并及時(shí)搖動(dòng)，使鍍銀充分。OCT包埋，用振動(dòng)切片機(jī)做150μm切片。切片又浸于2%重鉻酸鉀水溶液漂洗。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.3 樹(shù)突長(zhǎng)度及樹(shù)突棘計(jì)數(shù)分析

每只大鼠取20個(gè)mPFC第Ⅲ層錐體細(xì)胞，采用顯微鏡進(jìn)行采集圖片(見(jiàn)圖1)。因?yàn)閙PFC錐體細(xì)胞基樹(shù)突與冠狀位相平行，因此可對(duì)基樹(shù)突進(jìn)行分析［5］。用 ImageJ 6.0 軟件中 Sholl analyze(Sholl 1953)進(jìn)行樹(shù)突總長(zhǎng)度及分枝分析，同心圓與樹(shù)突交點(diǎn)的總數(shù)反映樹(shù)突總長(zhǎng)度及整體分枝情況［5］(見(jiàn)圖2)。在油鏡(1000×)下觀察基樹(shù)突上樹(shù)突棘的密度(見(jiàn)圖1右上角所示)。由于在樹(shù)突上樹(shù)突棘的分布并不是均一的，因此樹(shù)突棘的計(jì)數(shù)要取同一位置為起點(diǎn):從距離胞體30～60μm開(kāi)始直至樹(shù)突終末端［6］。

可用于圖像分析的錐體細(xì)胞入選標(biāo)準(zhǔn):(1)錐體細(xì)胞位于mPFC內(nèi);(2)錐體細(xì)胞需被充分染色以便于準(zhǔn)確觀察分析;(3)錐體細(xì)胞沒(méi)有被其他物體所掩蓋，如膠質(zhì)細(xì)胞、脈管系統(tǒng)及其他錐體細(xì)胞等;(4)錐體細(xì)胞基本完整，少有中斷或離斷現(xiàn)象。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

圖1 大鼠mPFC第3層錐體細(xì)胞

圖2 Sholl Analyze同心圓

2 結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)基于對(duì)600個(gè)mPFC錐體細(xì)胞進(jìn)行分析，經(jīng)鏡下觀察及數(shù)據(jù)分析，所得結(jié)果如下。

2.1 錐體細(xì)胞樹(shù)突長(zhǎng)度

同一時(shí)間段假手術(shù)組及手術(shù)組大鼠mPFC錐體細(xì)胞樹(shù)突與同心圓交點(diǎn)數(shù)無(wú)明顯差異，各時(shí)間段假手術(shù)組與手術(shù)組間錐體細(xì)胞與同心圓交點(diǎn)數(shù)亦無(wú)明顯差異(P ＞0.1)(見(jiàn)表1)。

表1 各組mPFC錐體細(xì)胞樹(shù)突與同心圓交點(diǎn)

2.2 錐體細(xì)胞樹(shù)突棘密度

術(shù)后2w模型組及假手術(shù)組mPFC樹(shù)突棘密度無(wú)明顯差異。術(shù)后8w兩組間樹(shù)突棘有明顯差異(P＜0.05)。隨著周齡增大手術(shù)組及假手術(shù)組樹(shù)突棘均有逐漸降低的趨勢(shì)，其中手術(shù)組樹(shù)突棘密度降低(術(shù)后2w及8w)有明顯差異(P＜0.05)(見(jiàn)表2、圖3)。

表2 各組mPFC錐體細(xì)胞樹(shù)突棘密度/20μm

圖3 手術(shù)組及假手術(shù)組各周樹(shù)突棘密度

3 討論

樹(shù)突棘是錐體細(xì)胞樹(shù)突上內(nèi)含肌動(dòng)蛋白的小突起，構(gòu)成大部分興奮性突觸的突觸后膜，是主要的信息加工及儲(chǔ)存的場(chǎng)所。突觸的可塑性在學(xué)習(xí)、記憶等過(guò)程中起到很重要的作用，樹(shù)突棘作為興奮性突觸的后膜，其密度及形態(tài)的變化與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。一個(gè)成熟的皮質(zhì)錐體細(xì)胞可以接收約15000個(gè)突觸所傳遞的信息，樹(shù)突棘的數(shù)目可以反映出錐體細(xì)胞間的信息聯(lián)系及傳遞程度。因此，可以通過(guò)對(duì)錐體細(xì)胞的樹(shù)突長(zhǎng)度、分枝及樹(shù)突棘的密度的測(cè)量來(lái)推斷細(xì)胞間的聯(lián)系［5，7］。

關(guān)于急性腦缺血后樹(shù)突棘變化的研究很多，但慢性腦缺血所致錐體細(xì)胞樹(shù)突形態(tài)變化少有報(bào)道。Zhang等人發(fā)現(xiàn)較為溫和的血流下降(～50%血流)，5h內(nèi)不會(huì)引起樹(shù)突棘的變化，但若血流嚴(yán)重下降(＜10%血流)，在10min內(nèi)樹(shù)突棘數(shù)量會(huì)急劇下降，且形態(tài)結(jié)構(gòu)會(huì)隨之發(fā)生改變，Li等也發(fā)現(xiàn)在急性腦缺血時(shí)樹(shù)突形態(tài)發(fā)生改變，兩者均觀察到若60min內(nèi)血流恢復(fù)，樹(shù)突及樹(shù)突棘形態(tài)均有所恢復(fù)［8，9］。說(shuō)明樹(shù)突棘形態(tài)結(jié)構(gòu)會(huì)隨短時(shí)間急劇下降的血流而隨之改變。

在慢性腦缺血的研究中，海馬區(qū)病變與認(rèn)知障礙密切相關(guān)。Wang等人在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)認(rèn)知功能障礙伴隨著海馬CA1區(qū)突觸密度的降低及突觸形態(tài)的改變［10］，參與細(xì)胞骨架形成的磷蛋白-微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)及標(biāo)記突觸小泡的蛋白-突觸素蛋白均進(jìn)行性減少［11］。這些研究均表明慢性腦低灌注影響海馬區(qū)樹(shù)突形成和突觸連接。

海馬和PFC與學(xué)習(xí)和記憶等腦高級(jí)認(rèn)知功能密切相關(guān)［12］。解剖學(xué)研究已經(jīng)證明，海馬和PFC之間存在單突觸聯(lián)系，即海馬前額葉回路。人們推測(cè)該回路可能對(duì)海馬和PFC這兩個(gè)重要的腦區(qū)的信息起協(xié)調(diào)和溝通作用，并極可能參與記憶等認(rèn)知功能。精神分裂癥(schizophrenia)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)等神經(jīng)、精神疾病患者都表現(xiàn)出工作記憶障礙和前額葉功能異常，并發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)失調(diào)密切相關(guān)［13］。

本實(shí)驗(yàn)利用高爾基染色法研究慢性腦缺血狀態(tài)下大鼠mPFC樹(shù)突形態(tài)的變化，是對(duì)錐體細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行直觀的觀察和分析。從而通過(guò)觀察慢性腦缺血情況下大鼠mPFC錐體細(xì)胞的形態(tài)變化，研究mPFC樹(shù)突及突觸的連接情況。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)600個(gè)mPFC錐體細(xì)胞的樹(shù)突長(zhǎng)度、分枝及樹(shù)突棘的密度進(jìn)行測(cè)量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，模型組大鼠mPFC樹(shù)突長(zhǎng)度及分枝與假手術(shù)組在各時(shí)間段均無(wú)明顯區(qū)別，但自術(shù)后4w及8w樹(shù)突棘密度較假手術(shù)組明顯降低。由此看來(lái)，樹(shù)突棘密度這一指標(biāo)對(duì)慢性腦缺血更為敏感。在實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后2w假手術(shù)組及模型組間樹(shù)突棘密度并無(wú)明顯差異，術(shù)后4、8w樹(shù)突棘密度逐漸減少，且均有顯著性差異，說(shuō)明短時(shí)間的慢性腦缺血狀態(tài)對(duì)樹(shù)突棘數(shù)目并無(wú)明顯影響，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，慢性腦缺血所造成的影響逐漸顯現(xiàn)，且逐漸加重。慢性腦缺血可能導(dǎo)致mPFC的突觸隨之減少，影響海馬-前額葉回路中信息的傳遞，進(jìn)而影響工作記憶等功能。這一結(jié)果與大量實(shí)驗(yàn)所示:2VO術(shù)后大鼠學(xué)習(xí)能力下降且進(jìn)行性加重相一致。

關(guān)于樹(shù)突棘缺失的原因尚不清楚?？赡芘c慢性腦缺血狀態(tài)下興奮性氨基酸升高、腦細(xì)胞損傷、自由基代謝障礙等病理過(guò)程相關(guān)。多項(xiàng)研究表明Ephephrin系統(tǒng)在腦內(nèi)多數(shù)區(qū)域，如海馬、皮質(zhì)、嗅球、小腦等均有表達(dá)，其主要功能是參與神經(jīng)細(xì)胞突觸發(fā)育及神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中可見(jiàn)，在慢性腦缺血模型中，體內(nèi)及體外試驗(yàn)均檢測(cè)到E-phA4持續(xù)升高［14］。EphA4可能與樹(shù)突棘的減少相關(guān)，EphB2可能與樹(shù)突棘增多相關(guān)?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)E-phA4或EphB2調(diào)控，改善樹(shù)突棘的表達(dá)，增加錐體細(xì)胞間突觸形成，從而改善認(rèn)知障礙。

總之，慢性腦缺血可以引起認(rèn)知功能損害，而這可能與PFC錐體細(xì)胞樹(shù)突棘密度降低從而導(dǎo)致有效突觸連接減少、影響信息傳遞有關(guān)。調(diào)節(jié)樹(shù)突棘形態(tài)及數(shù)目變化的機(jī)制尚不清楚，在今后的研究工作中，我們可以對(duì)樹(shù)突棘調(diào)控進(jìn)行更深一步的研究，通過(guò)調(diào)節(jié)樹(shù)突棘對(duì)認(rèn)知功能障礙患者進(jìn)行治療，可能提高患者認(rèn)知水平，改善生活質(zhì)量。

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