周辰珩， 金 瑩， 洪 慶， 蔡海波， 臧秋玲

帕金森病(PD)是以震顫、強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)減少三大癥狀為臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重危害中老年人的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未清楚。據(jù)報(bào)道線粒體功能紊亂與PD發(fā)病有關(guān)，環(huán)境中的有害化學(xué)物質(zhì)可能通過抑制線粒體中電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中的復(fù)合物Ⅰ而影響PD的發(fā)?。?］。目前圍繞其病因的爭(zhēng)論很多，其中線粒體功能與PD的相關(guān)性研究是近年來研究的熱點(diǎn)，本文針對(duì)編碼線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ基因的3個(gè)位點(diǎn)突變進(jìn)行研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取我院神經(jīng)內(nèi)科門診散發(fā)性帕金森病患者88例，男性48例，女性40例，年齡44～78歲，平均(60.3±11.2)歲，符合英國帕金森病學(xué)會(huì)腦庫的帕金森病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。選取60例中老年健康體檢者，男32例，女28例，無高血壓，糖尿病病史，年齡46～76歲，平均(62.0±9.5)歲。兩組的年齡、性別差異無顯著性。

1.2 儀器和試劑

Bio-RAD My cyclerTM PCR儀(伯樂公司，美國);Bio-Rad Gel Doc 2000D凝膠成像儀(伯樂公司，美國);2720 Thermal Cycler PCR儀(ABI公司，美國);YY-6C型電泳儀(六一儀器廠，北京);5418型離心機(jī)(Eppendorf公司，德國);2×PCR mixture(Tiangen公司，瑞士);Maker(Ferments公司，德國);膠回收純化試劑盒(AXYGEN公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1 DNA樣品制備 用酚/氯仿抽提法從研究對(duì)象外周靜脈血白細(xì)胞中提取基因組DNA。

1.3.2 PCR引物設(shè)計(jì)與合成 引物由上海生工合成，引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)［3］，見表1。

表1 三對(duì)線粒體NDA突變位點(diǎn)的PCR引物信息

1.3.3 PCR擴(kuò)增 以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總量25ml:上下游引物各 1.5ml，基因組 DNA 8ml，PCR mixture4μl，ddH2O10μl。PCR 條件:95℃預(yù)變性 5min，94℃變性30s，55℃退火 30s，72℃ 延伸 40s，循環(huán)數(shù)為 35 個(gè)，72℃延伸10min，10℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并在自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.4 DNA測(cè)序 PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序由上海桑尼生物科技有限公司完成。其步驟如下:AXYGEN回收試劑盒純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行定量;以BigDye Terminator V3.1測(cè)序試劑盒對(duì)純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，然后在ABI3730XL測(cè)序儀上進(jìn)行正反向測(cè)序;拼接序列繪制出測(cè)序結(jié)果，并定位分析線粒體DNA 3個(gè)位點(diǎn)附近的堿基改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增

對(duì)G1719A、G4580A、C7028T 3個(gè)線粒體基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在2%瓊脂糖凝膠中可見產(chǎn)物條帶都位于200bp。見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 PD基因突變分析

對(duì)21例異常基因位點(diǎn)進(jìn)行DNA測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因位點(diǎn)突變，反而在其附近發(fā)現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)突變，在G1719A附近有4例1711(G→A)1738(A→G)，3例 1738(A→G)，1例 1664(G→A)突變;在G4580A附近有1例4476(A→G)，1例4638(A→G)，1例4651(－→T)突變;在 C7028T附近有1例6984(C→T)，1例 6979(G→C)6984(C→T)，3例7083(C→ －)，4例6963(G→A)，1例6910(C→A)突變。對(duì)照組無發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。

2.3 突變類型測(cè)序

11種突變類型測(cè)序結(jié)果見圖2～圖4。G1719A附近基因位點(diǎn)突變測(cè)序圖譜(見圖2):1711(G→A)1738(A→G)，1738(A→G)，1664(G→A);G4580A附近基因位點(diǎn)突變測(cè)序圖譜(見圖3):4476(A→G)，4638(A→G)，4651(－→T);C7028T處基因位點(diǎn)突變測(cè)序圖譜(見圖4):6984(C→T)，6910(C→A)，6963(G→A)，7083(C→ －)，6979(G→C)6984(C→T)。

3 討論

帕金森病是一種常見的晚發(fā)性神經(jīng)退行性病變，病理變化以中腦黑質(zhì)部位多巴胺神經(jīng)元的死亡和路易體的形成為特征。PD神經(jīng)元死亡的主要形式是細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡過程中線粒體起著中心調(diào)控作用。

最近幾年，遺傳和流行病學(xué)方面的證據(jù)表明，大多數(shù)PD患者為散發(fā)性，PD來自母系遺傳，提出線粒體基因組的改變可能是PD發(fā)病的根源［4］。mtDNA是獨(dú)立與核染色體NDA以外的基因組，其基因產(chǎn)物均直接或間接與細(xì)胞的氧化和磷酸化有關(guān)，氧化磷酸化是腦細(xì)胞能量的主要來源，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞生存/死亡中起關(guān)鍵作用，有關(guān)線粒體DNA增殖的機(jī)制:一是可能存在代謝反饋系統(tǒng)，細(xì)胞通過刺激線粒體增殖代償減少氧化磷酸化能力;另外一個(gè)可能是野生型線粒體DNA順式控制作用，由于基因突變被抑制或失活，突變型線粒體DNA的量超過野生型，導(dǎo)致與細(xì)胞能量及代謝需要無關(guān)的突變型過度增加［5］。mtDNA的突變能影響與呼吸鏈有關(guān)的酶和氧化磷酸化過程，造成線粒體氧化磷酸化功能障礙，而且mtDNA突變引起電子傳遞鏈的功能缺陷增加線粒體中反應(yīng)性氧自由基的生成，形成反應(yīng)性氧自由基的惡性循環(huán)，同時(shí)，線粒體功能失調(diào)，能量不足，引起多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞死亡，組織細(xì)胞退行性病變，最終導(dǎo)致PD的發(fā)病［4～6］。本研究發(fā)現(xiàn)的多個(gè)mtNDA位點(diǎn)的突變也可能經(jīng)過上述的機(jī)制造成PD的發(fā)病。

圖2 G1719A處基因位點(diǎn)突變測(cè)序圖譜

圖3 G4580A處基因位點(diǎn)突變測(cè)序圖譜

圖4 C7028T處基因位點(diǎn)突變測(cè)序圖譜

本研究針對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道與PD有關(guān)的編碼呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ基因位點(diǎn)G1719A、G4580A、C7028T進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)21例異常基因位點(diǎn)進(jìn)行DNA測(cè)序，并沒有發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因位點(diǎn)的突變，反而在其附近發(fā)現(xiàn)了多個(gè)位點(diǎn)的突變，共發(fā)現(xiàn)11種突變類型，對(duì)照組無發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，預(yù)示患者的線粒體功能受損，這可能與這些位點(diǎn)的突變率低、個(gè)體異質(zhì)性以及地域差異等有關(guān)，這與蔣義國等［6］的研究結(jié)果類似。本研究盡管發(fā)現(xiàn)了PD患者mtNDA的多個(gè)位點(diǎn)突變，但不能肯定這些位點(diǎn)的突變對(duì)于PD具有臨床或病理意義，因?yàn)槲覀儾恢榔渚烤故峭x突變還是錯(cuò)義突變，有待繼續(xù)深入研究。

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