陳 劍, 紀(jì)燁斌, 張 能, 謝昌平

(海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院,儋州 571737)

短穗魚尾葵灰斑病菌的鑒定及生物學(xué)特性*

陳 劍, 紀(jì)燁斌, 張 能, 謝昌平**

(海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院,儋州 571737)

[目的]明確引起短穗魚尾葵灰斑病的病原菌及該菌的生物學(xué)特性。[方法]從短穗魚尾葵感病組織上分離、純化病菌,經(jīng)致病性測定后根據(jù)其形態(tài)特征進(jìn)行種類鑒定,并測定其在不同培養(yǎng)條件下的生物學(xué)特性。[結(jié)果]引起短穗魚尾葵灰斑病的病原菌為小孢擬盤多毛孢菌[Pestalotiopsis microspora(Speg.)Satista&Peresapud Batista]。該菌在PSA培養(yǎng)基上長勢最好;菌絲生長和孢子萌發(fā)的最適溫度為25℃;完全光照條件最利于菌絲的生長和產(chǎn)孢;在pH5時菌絲生長最好,pH6時孢子萌發(fā)率最高,pH2時孢子不萌發(fā);孢子的致死溫度為50℃。[結(jié)論]上述結(jié)果可以為短穗魚尾葵灰斑病的防治提供依據(jù)。

短穗魚尾葵; 擬盤多毛孢菌; 生物學(xué)特性

*致 謝: 在試驗(yàn)過程中,廣西大學(xué)韋繼光老師和河南科技大學(xué)劉愛榮老師對病原鑒定給予了幫助,謹(jǐn)表示衷心的感謝!

**通信作者 Tel:0898-23306865;E-mail:xiechangping002@sina.com

短穗魚尾葵(Caryota mitisLoureiro)別名叢立孔雀椰子,為叢生常綠小喬木,樹形優(yōu)美,葉色濃綠[1],在公共綠化,庭園栽培,室內(nèi)擺設(shè)等方面都有廣泛的應(yīng)用,是一種重要的園林景觀樹種。近年來隨著城市綠化、家庭觀賞和插花的應(yīng)用,短穗魚尾葵的栽培逐漸增加。而由擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsisspp.)真菌引起的短穗魚尾葵灰斑病發(fā)生也日益嚴(yán)重,發(fā)病時葉片上病斑累累,葉片變黃干枯,嚴(yán)重時枝條回枯,甚至整株枯萎。嚴(yán)重影響了短穗魚尾葵的觀賞價值。對棕櫚科植物擬盤多毛孢菌引起的病害已有報道和描述,但未對短穗魚尾葵灰斑病進(jìn)行詳細(xì)報道[2-6]。為此作者對該病的病原菌進(jìn)行了鑒定和生物學(xué)特性研究,為采取有效的防治措施提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料來源

發(fā)病材料來自海南大學(xué)儋州校區(qū)校園內(nèi)的短穗魚尾葵。

1.2 病原菌分離與純化

采用常規(guī)組織分離方法[7],從感病葉片和葉柄上分離病原菌。并將從葉片和葉柄上分離所得的病原菌分別標(biāo)記為C1和C2菌株。采用瓊脂平板稀釋純化法進(jìn)行純化,再將純化的C1和C2菌株分別轉(zhuǎn)入試管斜面保存以供測定。

1.3 病原菌致病性測定

將C1和C2菌株的菌絲塊分別接種于健康無病的葉片和葉柄上,采用刺傷和無傷兩種接種方法,接種后保濕。以接種滅菌的瓊脂塊作為對照,逐日觀察并記錄其發(fā)病情況。

1.4 病原菌形態(tài)觀察

將純化的第2代菌株分別接種在PDA培養(yǎng)基上,在全光照(光照強(qiáng)度為3 000 lx),25℃條件下,培養(yǎng)5 d后,觀察菌落顏色、形狀、大小和產(chǎn)孢情況以及在顯微鏡下觀察分生孢子的顏色、形態(tài)和大小。

1.5 病原菌生物學(xué)特性的測定

1.5.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

用滅菌的打孔器(直徑4.5 mm)取菌落邊緣的菌絲塊,分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基(PCA)、Czapek培養(yǎng)基、Richards培養(yǎng)基等5種培養(yǎng)基平板中央,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)。每個處理重復(fù)3次,培養(yǎng)5 d后,觀察菌絲生長狀況(菌落直徑和形態(tài))及產(chǎn)孢情況(下同)。

1.5.2 溫度對菌絲生長的影響

將菌絲塊接種在PDA培養(yǎng)基平板中央,分別置于5、10、15、20、25、30 ℃和35 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫光照培養(yǎng)。

1.5.3 孢子致死溫度的測定

該菌培養(yǎng)后在菌落表面產(chǎn)生分生孢子盤,從菌落表面產(chǎn)生的孢子堆中挑取孢子,放入5 mL蒸餾水,配制成孢子懸浮液;在低倍鏡(10×10)下檢查孢子數(shù),用蒸餾水調(diào)節(jié)懸浮液,直至每視野的孢子數(shù)為30～35個。在直徑為1 cm的試管中預(yù)先放入2 mL的蒸餾水,分別在恒溫水浴鍋中預(yù)熱至40、45℃和50℃(試管內(nèi)的溫度用溫度計測量),然后滴加數(shù)滴預(yù)先配制好的孢子懸浮液,處理10 min;取出,用接種環(huán)取孢子懸浮液均勻地涂于涂上PDA培養(yǎng)基的載玻片上,保濕,放置在25℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng),6 h后,用 1 g/L的HgCl2固定,檢查孢子萌發(fā)情況。孢子萌發(fā)以芽管長度超過孢子直徑長度(指直徑小的一邊)的一半為標(biāo)準(zhǔn)(下同)[7]。

1.5.4 光照對菌絲生長的影響

將菌絲塊接種在PDA平板中央,分別置于完全光照、黑暗和光照各12 h、完全黑暗3種光照環(huán)境中,在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.5 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

制作培養(yǎng)液(PDA培養(yǎng)基不加瓊脂),分別調(diào)節(jié)pH 到 2、3、4、5、6、7、8、9,加入卡拉膠,滅菌,重新測定調(diào)節(jié)pH;測定不同pH對菌絲生長的影響時,取菌落邊緣的菌絲塊(PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d),接種在不同pH的PDA培養(yǎng)基平板中央,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)。

測定不同pH對孢子萌發(fā)的影響時,將不同pH的PDA培養(yǎng)基均勻地涂在載玻片上,用蒸餾水配制孢子懸浮液,均勻涂在培養(yǎng)基上,保濕,在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),6 h后,用1 g/L的HgCl2固定,觀察并記錄孢子萌發(fā)數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 癥狀特點(diǎn)

該病主要危害短穗魚尾葵的葉片和葉柄。葉片上病斑多發(fā)生在葉尖和葉緣,發(fā)病初期在葉片上出現(xiàn)水漬狀褪綠色的小點(diǎn),病斑逐漸擴(kuò)展成淺褐色橢圓形或不規(guī)則形小斑,病斑大小為1～3 mm,病斑周圍有黃色的暈圈或無;隨病斑的進(jìn)一步擴(kuò)大,多個病斑愈合成不規(guī)則形的大斑,病斑中央呈灰白色,邊緣顏色呈深褐色,在病斑中央散生許多小黑點(diǎn),發(fā)病嚴(yán)重時整葉干枯。葉柄的癥狀與葉片相似,但是無黃色的暈圈,病斑不凹陷,嚴(yán)重時枝條回枯,甚至整株枯萎(圖1a,b)。

2.2 病原菌的致病性

接種保濕4 d后刺傷葉片發(fā)病,無傷葉片和對照不發(fā)病。并且C1和C2菌株接種于葉片和葉柄上發(fā)病癥狀均與大田癥狀相同。說明C1和C2是短穗魚尾葵灰斑病的致病菌,且C1和C2均能分別引起葉片和葉柄發(fā)病。同時,也說明該病原菌僅能通過傷口侵入。

2.3 病原菌的形態(tài)

C1和C2菌株均可致病,引起的癥狀相同。C1菌株在PDA培養(yǎng)基上生長迅速,菌落近圓形,邊緣不平滑,菌絲白色絮狀,菌絲層分布均勻,背面淡米黃色,在光照條件下有分布不均勻的青色斑塊,無明顯輪紋。10 d后產(chǎn)生黑色的分生孢子盤,分生孢子長梭形,有的稍微彎曲,4隔5胞,分生孢子大小(18.2～ 28.6)(22.7)μ m ×(5.2 ～ 7.8)(5.9)μ m;中間3個細(xì)胞著色,顏色相同,為淡褐色,分隔處顏色加深;色胞長10.4～ 18.2(14.1)μ m;頂胞和尾胞均為三角形,無色透明,頂胞上著生無色附屬絲2～3根,長10.4～26.0(16.2)μ m,尾胞上著生一根基部附屬絲,中生,長3.9～9.1(5.2)μ m。分生孢子芽管從第3個有色胞萌發(fā),首先第3色胞膨大變圓,然后從其一邊或兩邊同時形成凸起的芽管,芽管慢慢伸長變成根狀的細(xì)管,隨著芽管的伸長第3色胞逐漸收縮,整個孢子也隨之漸漸收縮,最后芽管長成菌絲,分生孢子也整個萎縮(圖1c,d和e)。通過對C2菌株與C1菌株在培養(yǎng)性狀、分生孢子大小和形態(tài)、有色胞長度、頂端和尾端附屬絲長度以及孢子萌發(fā)等情況進(jìn)行比對,判斷C1和C2菌株為同一菌株。

圖1 短穗魚尾葵灰斑病癥狀和病原

2.4 病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1 培養(yǎng)基對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

5種培養(yǎng)基中,PSA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上菌落直徑明顯比其他3種大。PSA和PDA培養(yǎng)基菌落直徑無明顯差異,PCA培養(yǎng)基上最小。病原菌在5種培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d均不能產(chǎn)生分生孢子(表1)。

2.4.2 溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

菌絲在 10～30℃范圍內(nèi)均能生長。在10～25℃范圍內(nèi),菌落直徑隨溫度升高而逐漸增大,25℃時菌落直徑最大,在10℃和30℃時菌絲生長極緩慢,5℃和35℃時停止生長;可見該病原菌的生長最適溫度為25℃。孢子在5～35℃范圍內(nèi)均能萌發(fā),在5～25℃范圍內(nèi),孢子萌發(fā)率隨溫度升高而逐漸增大,25℃時孢子萌發(fā)率最大。在25～35℃的范圍內(nèi),孢子萌發(fā)率隨溫度升高而逐漸減小(圖2)。

表1 培養(yǎng)基對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響1)

圖2 溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

2.4.3 孢子的致死溫度

40℃水浴處理后,孢子萌發(fā)率為88%;45℃水浴處理后,孢子萌發(fā)率為20%;50℃水浴處理后,孢子不萌發(fā);可見孢子的致死溫度是50℃。

2.4.4 光照對菌絲生長的影響

完全光照條件下,菌落直徑最大,完全黑暗條件下菌落直徑最小,完全光照和完全黑暗下菌絲生長差異明顯;3種光照中只有完全光照能產(chǎn)孢,說明光照對病原菌的菌絲生長和促進(jìn)產(chǎn)孢有著重要的影響(表2)。比pH為8和9的堿性條件好,由此可以看出偏酸性條件對菌絲生長較有利。pH為3～9時,孢子均能萌發(fā)。pH為6時孢子萌發(fā)率最高為96%,pH為2時不萌發(fā),其他 pH條件下孢子的萌發(fā)率均在80%以上(pH2～6時,孢子萌發(fā)率隨pH的增大而增大;pH為6～9時,孢子萌發(fā)率隨pH的增大而減小)(圖3)。

圖3 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

表2 光照對菌絲生長的影響1)

2.4.5 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

pH為2～9時,菌絲均能生長;pH為5時菌絲生長最好;pH為2～5時,菌落直徑隨pH的增大而逐漸變大;pH為5～9時,菌落直徑隨pH的增大而逐漸變小。pH為3和4的酸性條件菌絲生長要

3 結(jié)論與討論

目前,全世界已報道Pestalotiopsisspp.有241種,對這些種的確定,主要根據(jù)培養(yǎng)性狀、分生孢子的形態(tài)、大小、有色胞的長度和顏色、頂端附屬絲和尾端附屬絲的長度等的差別來確定新種。作者根據(jù)第2代的菌株進(jìn)行鑒定,并與張家祥報道的危害短穗魚尾葵的3種擬盤多毛孢屬種類烏索拉擬盤多毛孢[P.eusora(Sacc.)J.X.Zhang et T.Xu comb.nov.]、勞格頓擬盤多毛孢[P.laughtonae(DOIdge)J.X.Zhang et T.Xu comb.nov.]、三毛草擬盤多毛孢[P.triseta(M.&Mme.F.Moreau)Stey.][5]進(jìn)行比對(表3)。其中最為關(guān)鍵的特征是3個有色胞的顏色,在這4個種中,僅有P.microspora的3個色胞是同色的,其余3個種均為異色的。同時,P.triseta的分生孢子明顯較P.microspora大,而且頂端附屬絲長度也較長(表3)。

表3 4種擬盤多毛孢的大小和有色胞顏色的比對

通過比對[9-10],確定該病原菌為小孢擬盤多毛孢[P.microspora(Speg.)Satista&Peresapud Batista]。雖然我們所測得的分生孢子大小、頂端附屬絲和尾端附屬絲長度與烏索拉擬盤多毛孢、勞格頓擬盤多毛孢和小孢擬盤多毛孢有一定的差別,這可能是我們的培養(yǎng)代數(shù)不同所致,而每增加一代對分生孢子大小、頂端附屬絲和尾端附屬絲長度的影響情況如何,將有待進(jìn)一步研究。

通過對病原菌的致病性和生物學(xué)特征的研究表明,該病原菌的侵入途徑主要是傷口,菌絲最適的生長溫度是25℃,5℃和35℃時菌絲停止生長,完全光照最有利于菌絲生長和促進(jìn)產(chǎn)孢;在pH5時菌絲生長最好,這與葛起新等[11]報道是一致的。

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Identification of the pathogen of gray leaf spot on Caryota mitis and its biological characteristics

Chen Jian, Ji Yebin, Zhang Neng, Xie Changping
(College of Environmental and Plant Protection,Hainan University,Danzhou571737,China)

[Objective]To identify the pathogen causing the gray leaf spot ofCaryota mitisLoureiro and understand its biological characteristics.[Method]The pathogen was isolated and purified from the infectedC.mitis,and its pathogenicity to the host and its biological characteristics were tested.The pathogen was identified according to its characters.[Result]Gray leaf spot ofC.mitiswas caused byPestalotiopsis microspora(Speg.)Satista&Peresapud Batista.The pathogen growth in the medium PSA was the best;The optimum temperature for hyphal growth and spore germination was 25℃.Full illumination was most conducive to hyphal growth and sporulation.Hyphal growth was the best at pH 5,and spore germination rate was the highest at pH 6,but pH 2 was not inhibitory to germination.The lethal temperature for spores was 50℃.[Conclusion]The results could provide a reference for the control of the gray leaf spot ofC.mitis.

Caryota mitis;Pestalotiopsis microspora; biological characteristics

S 436.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.04.010

2010-07-09

2010-08-23

海南大學(xué)科技基金項(xiàng)目(Rnd0524)