袁 征,徐文娟,彭 偉

血管內(nèi)皮細胞的損傷及功能紊亂與高血壓、冠心病及糖尿病等多種疾病的發(fā)生密切相關,其中,細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細胞間黏附分子-1(vascular cellular adhesionmolecule-1,VCAM-1)和顆粒膜蛋白(PS)的含量變化與血管內(nèi)皮細胞損傷密切相關[1]。本實驗以AngⅡ建立血管內(nèi)皮細胞損傷模型,以加味芎藭湯含藥血清為干預因素,觀察含藥血清對血管內(nèi)皮細胞分泌的ICAM-1、VCAM-1和PS含量的影響,為加味芎藭湯治療與血管內(nèi)皮損傷相關聯(lián)的疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品 加味芎藭湯中之銀杏葉、當歸、酒大黃、川芎均由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房提供,并經(jīng)山東中醫(yī)藥大學中藥學院中藥鑒定教研室鑒定為正品。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)由美國Sigma公司提供;卡托普利由山東濰坊制藥廠提供,批號:10910005。

1.2 試劑 DMEM干粉培養(yǎng)、胎牛血清(FCS)、過氧化氫(H2O2)、胰蛋白酶,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(M TT),美國Gibco公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO),天津市福辰化學試劑廠;酶聯(lián)免疫吸附法ICAM-1與VCAM-1和PS測定試劑盒購自美國BPB生物醫(yī)學有限公司。

1.3 儀器 水套式二氧化碳孵箱,美國Nuaire公司產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡,全自動生化分析儀:AU1000型,日本OLYMPUS公司產(chǎn)品;超凈工作臺,蘇州凈化設備公司產(chǎn)品;酶聯(lián)免疫檢測儀,華東電子管廠產(chǎn)品;LX808動力學定量繪圖酶標儀,美國寶特原裝進口產(chǎn)品。實驗用細胞人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(ECV-304),購自山東省醫(yī)學科學院,由美國組織培養(yǎng)庫ATTCCCRI-1998引進)。

1.4 含藥血清制備 雄性Wiatar大鼠10只,加味芎藭湯按13.3 g/(kg?d)灌胃給藥,連續(xù)7 d,于末次給藥2 h后,麻醉,取血,無菌分離血清,經(jīng)56℃、30 min滅活后,配置含藥血清培養(yǎng)液備用。

1.5 細胞培養(yǎng)與分組 采用胰蛋白酶消化傳代血管內(nèi)皮細胞,倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài),采用4～6代細胞用于實驗。隨機分組。①DMSO溶媒對照組;②AngⅡ組:AngⅡ2×10-7mol/L;③卡托普利組:AngⅡ2×10-7mol/L+160 mg/L卡托普利;④30%含藥血清組:AngⅡ2×10-7mol/L+30%含藥血清;⑤20%含藥血清組:AngⅡ2×10-7mol/L+20%含藥血清;⑥10%含藥血清組:AngⅡ2×10-7mol/L+10%含藥血清;⑦5%含藥血清組:AngⅡ2×10-7mol/L+5%含藥血清,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.6 細胞增殖活性測定 將4×104/mL細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板,每孔200 μ L(8×103/孔)細胞懸液,同上分組和培養(yǎng)后,每組設4個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)44 h,換含1%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液,每孔加入 MT T 20 μL(5 mg/mL),溫育4 h,每孔加入 150 μ L DMSO,混勻后于酶標儀波長490 nm處測吸光度(OD),以OD值來表示細胞增殖活性。

1.7 細胞培養(yǎng)上清液 ICAM-1、VCAM-1和PS含量 采用酶聯(lián)免疫法(Elisa法)測定 ICAM-1、VCAM-1和 PS含量。繪制校正曲線,以標準品濃度作縱坐標,OD值作橫坐標。

2 結(jié) 果

2.1 血管內(nèi)皮細胞形態(tài)觀察 低倍光鏡下觀察可見,內(nèi)皮細胞貼壁生長。細胞呈單層扁平或多角形細胞。細胞核為圓形或橢圓形,核內(nèi)染色質(zhì)稀疏空亮,可見一兩個核仁。細胞生長融合形成單層,呈典型的鵝卵石或鋪路石鑲嵌狀排列生長。傳代12 h后,可見細胞生長增殖呈小簇狀生長,24 h后,細胞生長形成細胞群細胞團塊中間較密,周邊細胞多為長梭形并游離向外生長。

2.2 對細胞增殖的影響 與DMSO溶媒組相比,AngⅡ各濃度組人血管內(nèi)皮細胞增殖顯著升高。選取2×10-7mol/L AngⅡ體外干預人血管內(nèi)皮細胞以引起細胞增殖。與AngⅡ組比較,200μ g/mL～400 μ g/mL各劑量卡托普利組細胞增殖活度均顯著減少(P＜0.05)。與AngⅡ組比較,5%～20%各劑量含藥血清組的細胞增殖活度均顯著減少(P＜0.05)。含藥血清在5%～20%劑量范圍內(nèi)能抑制AngⅡ?qū)?nèi)皮細胞的增殖效應,但作用強度有別。30%含藥血清組呈色極弱,鏡下觀察細胞數(shù)量較少,大量細胞死亡,表明30%含藥血清對ECV304細胞增殖有極強的抑制作用,推測具有一定的細胞毒性效果。1%含藥血清組呈色較強,接近正常細胞組,鏡下觀察細胞生長狀況良好,表明在該劑量對ECV304增殖無明顯的抑制作用。詳見表1。

表1 各組OD值的比較(±s)

表1 各組OD值的比較(±s)

組別 n 劑量 OD值DMSO溶媒組 4 ― 0.64±0.12 AngⅡ模型組 4 1×10-7mol/L 0.83±0.231)4 2×10-7mol/L 1.02±0.071)4 10×10-7mol/L 0.60±0.20卡托普利組 4 50 μ g/mL 0.66±0.052)4 200 μ g/mL 0.59±0.022)4 400 μ g/mL 0.48±0.132)4 1 000 μ g/mL 0.16±0.022)含藥血清組 4 1% 0.61±0.05 4 5% 0.55±0.10 4 10% 0.34±0.023)4 20% 0.25±0.023)4 30% 0.13±0.043)與DMSO溶媒組比較,1)P＜0.05;與AngⅡ模型組比較,2)P＜0.05;與卡托普利組比較,3)P＜0.05

2.3 對細胞培養(yǎng)上清液ICAM-1、VCAM-1和PS含量的影響

各組與DMSO組比較內(nèi)皮細胞中的PS含量均明顯降低(P＜0.05)。模型組PS含量明顯降低,加入各組含藥血清后PS均有明顯升高,其中含藥血清的藥效比較為:卡托普利組＞10%組＞5%組＞20%組＞30%組。詳見表2。

模型組VCAM-1含量明顯升高(P＜0.05),加入各組含藥血清后VCAM-1均有明顯降低(P＜0.05),其中含藥血清的藥效比較為:20%組＞卡托普利組＞10%組＞5%組＞30%組。詳見表2。

模型組ICAM-1含量明顯上升(P＜0.05),加入各組含藥血清后ICAM-1均有明顯降低(P＜0.05),其中含藥血清的藥效比較為:卡托普利組＞10%組＞20%組＞30%組＞5%組。詳見表2。

表2 各組ICAM-1、VCAM-1、PS表達的比較(±s)ng/mL

表2 各組ICAM-1、VCAM-1、PS表達的比較(±s)ng/mL

組別 n ICAM-1 VCAM-1 PS DMSO溶媒組 6 38.80±13.28 26.17±3.63 13.19±7.08 AngⅡ模型組 6 53.11±5.88 52.58±38.432) 7.00±1.222)卡托普利組 6 33.00±1.991)2) 28.46±3.90 9.45±0.792)30%含藥血清組 6 46.94±15.67 48.35±21.252) 6.52±1.832)20%含藥血清組 6 35.77±5.941) 24.69±2.18 7.40±1.782)10%含藥血清組 6 35.35±4.901) 29.40±3.98 8.01±0.912)5%含藥血清組 6 48.78±10.37 38.92±6.54 7.91±1.392)與AngⅡ模型組比較,1)P＜0.05;與DMSO溶媒組比較,2)P＜0.05

3 討 論

目前認識的黏附分子主要有ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素和P-選擇素。黏附分子參與內(nèi)皮細胞、白細胞和血小板之間以及血管內(nèi)皮基質(zhì)之間的相互黏附與作用,導致炎癥反應[1]。ICAM-1與VCAM-1的濃度升高被認為是內(nèi)皮細胞活化和炎癥的標志[2]。

ICAM-1和VCAM-1同屬于免疫球蛋白超家族成員。ICAM-1廣泛地表達在各種血源性和非血源性細胞的表面,如白細胞、血管內(nèi)皮細胞等,通過與其配體β整合素-白細胞功能相關抗原1(LFA-1)和Mac-1(CD11b/CD18)的結(jié)合,主要介導多形核白細胞、淋巴細胞和單核細胞的黏附,促進炎癥的發(fā)生和發(fā)展[3]。Min等[4]通過實驗證實VEGF能使白細胞與內(nèi)皮細胞黏附增加,并使內(nèi)皮細胞表面ICAM-1與VCAM-1的表達增加。

PS是選擇素家族的重要成員,又名膜顆粒蛋白。P-選擇素主要分布于血小板表面和內(nèi)皮細胞Weibel-Palade小體中,在內(nèi)皮細胞活化時,P-選擇素迅速表達在細胞膜上,介導白細胞和內(nèi)皮細胞的起始黏附,并增加血管內(nèi)皮細胞表面黏附分子的親和力[5]。因此,PS在細胞表面的表達是內(nèi)皮細胞和血小板活化的標志,它參與介導血小板的活化及內(nèi)皮細胞與中性粒細胞和單核細胞的黏附,在炎癥、血栓形成中起重要作用。PS與其配體結(jié)合后起信號傳遞作用,活化靶細胞或改變其功能狀態(tài),從而介導白細胞-內(nèi)皮細胞,參與血管局部的炎癥反應,進一步加重內(nèi)皮細胞損傷[6]。

ICAM-1和VCAM-1表達于受刺激迅速分泌PS的活化內(nèi)皮細胞表面,通過與其相應配體結(jié)合介導白細胞與血管壁接觸,并使白細胞在激活的內(nèi)皮細胞表面緊密黏附,阻塞了毛細血管微循環(huán),進一步加重內(nèi)皮細胞損傷。Kacimi等[7]發(fā)現(xiàn)炎癥因子白介素(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)可以增加內(nèi)皮細胞、白細胞表面ICAM-1與VCAM-1的表達,促進二者的黏附,加重內(nèi)皮細胞損傷。

加味芎藭湯由銀杏葉、當歸、酒大黃、川芎組成,具有活血祛瘀、行氣通脈之功,是治療急性腦缺血有效復方。抑制急性腦缺血大鼠模型腦皮質(zhì)局部和血液中白細胞的ICAM-1表達和白細胞的聚集,發(fā)揮改善急性腦缺血的作用。但否能夠抑制白細胞和內(nèi)皮細胞的黏附與聚集尚不清楚。本實驗選擇AngⅡ建立血管內(nèi)皮細胞損傷為研究對象,以加味芎藭湯含藥血清干預手段,觀察到加味芎藭湯含藥血清降低內(nèi)皮細胞分泌的ICAM-1、VCAM-1,升高內(nèi)皮細胞分泌的PS,從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮的黏附功能。

[1]Shebuski RJ,Kilgore KS.Role of inflammatory mediators in thrombogenesis[J].Pharmacol Exp Ther,2002,300(3):729-735.

[2]Brahmachary M,Krishnan SP,Koh JL,et al.ANT JMIC:A database of antimicrobials seqences[J].Nucleic A acids Res,2004,32(Database issue):D586-D589.

[3]陳建糧.細胞間粘附分子-1表達的調(diào)控[J].國外醫(yī)學:免疫學分冊,2000,23(5):272-274.

[4]Min JK,Lee YM,Kim JH,et al.Hepatocy te growth factor suppresses vascular endothelial g rowth factor-inducedex pression of endothelial ICAM-1 and VCAM-1 by inhibiting the nuclear factor-B pathway[J].Circ Res,2005,96(3):300-307.

[5]T okac M,Ozeren A,Aktan M,et al.T he role of inflammation markers in triggering acute coronary events[J].Heart Vessels,2003,18(4):171-176.

[6]劉文東.冠心病患者血漿P-選擇素水平的變化[J].濰坊醫(yī)學院學報,2005,27(6):435-436.

[7]Kacimi R,Karliner JS,Koudssi F,et al.Ex pression and regulation of adhesion molecules in cardiac cells by cytokines response to acute hy poxia[J].Circ Res,1998,82(5):576-586.