羅 麗,張 健,董 宇,孫中文,李小寧,陸阿明,劉承宜

大鼠骨骼肌纖維化形成過程中IGF21、TGF2 β1的表達(dá)

羅 麗1,張 健2,董 宇3,孫中文4,李小寧4,陸阿明1,劉承宜5

目的:從胰島素樣生長(zhǎng)因子21(insulin2like growth factor21,IGF21)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子2 β1 (transforming growth factor2 β1,TGF2 β1)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律理解骨骼肌纖維化的發(fā)生機(jī)制。方法:健康雄性Sprague2Dawley大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組。模型組進(jìn)一步分為損傷后第1、2、3、7、14、21和28天組。模型組采用局部鈍物打擊造成急性骨骼肌鈍挫傷。免疫組織化學(xué)法同步觀察大鼠骨骼肌纖維化形成過程中IGF21、TGF2 β1的表達(dá),并采用有序樣品聚類分析方法對(duì)表達(dá)強(qiáng)度變化進(jìn)行分期。結(jié)果:1)模型組IGF21在損傷區(qū)域的表達(dá)顯著上調(diào),除了表達(dá)于再生肌纖維外,在肉芽組織和增生的結(jié)締組織中也可見陽性表達(dá),在塑型期尤為明顯。模型組IGF21表達(dá)強(qiáng)度呈倒“V”字形變化,可分為3期:損傷后第1～7天為第1期,損傷后第14～21天為第2期,損傷后第28天為第3期,其中第2期最高。2)模型組TGF2 β1表達(dá)顯著上調(diào),主要表達(dá)于新生肌細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì),表達(dá)強(qiáng)度呈現(xiàn)“V”字形變化,也分為3期:損傷后第1～2天為第1期,損傷后第3～14天為第2期,損傷后第21～28天為第3期,其中第2期最低。結(jié)論:IGF21、TGF2 β1在骨骼肌損傷修復(fù)過程中均高水平表達(dá)。在損傷期和修復(fù)期,二者可能共同參與骨骼肌再生和細(xì)胞外基質(zhì)再生,并且可能存在協(xié)同作用。在組織塑型期,二者均高水平表達(dá)于細(xì)胞間質(zhì)(特別是增生的結(jié)締組織),二者可能共同參與了骨骼肌纖維化的形成。

骨骼肌纖維化;胰島素樣生長(zhǎng)因子21;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子2 β1;鼠;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

骨骼肌纖維化是骨骼肌慢性疾病和外傷的病理性標(biāo)志之一,大量的纖維化會(huì)阻礙肌纖維的再生及其收縮功能、力學(xué)性能的恢復(fù)[20,10,11]。骨骼肌損傷發(fā)生后,多個(gè)細(xì)胞通路被激活以修復(fù)損傷組織,對(duì)參與骨骼肌損傷修復(fù)過程中的生長(zhǎng)因子及其受體、激酶以及其他介質(zhì)的深入研究將為有效治療這一病變提供有力的依據(jù)。

胰島素樣生長(zhǎng)因子21(insulin2like growth factor21,IGF2 1)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子2 β1(transforming growth factor2 β1,TGF2 β1)是骨骼肌再生與修復(fù)過程中的兩個(gè)重要的生長(zhǎng)因子。以往的研究認(rèn)為,IGF21在促進(jìn)骨骼肌再生方面起關(guān)鍵作用[12,19],TGF2 β1則主要被看作是肌肉再生的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,是纖維化的始動(dòng)因子[12,19],有關(guān)應(yīng)用外源性IGF21或IGF21轉(zhuǎn)基因靶向表達(dá)等方法促進(jìn)骨骼肌損傷愈合,預(yù)防纖維化的研究報(bào)道很多[9,24,29],然而,其最終療效并不滿意,可發(fā)生肌肉過度增生[29],并不同程度地伴有骨骼肌纖維化和瘢痕形成[31]。抑制TGF2 β1激活的信號(hào)通路的藥物(蘇拉明[11]、結(jié)蛋白[26]、r2干擾素[17]等)提供了新穎的抗纖維化策略,但這些藥物都在一定程度上存在副作用[28]; Denton CP等[14]應(yīng)用TGF2 β1抗體治療系統(tǒng)性硬化的隨機(jī)、安慰劑對(duì)照I/II期臨床試驗(yàn)表明,TGF2 β1多克隆抗體(CAT2192)沒有療效,且增加了病死率。

最近的研究發(fā)現(xiàn),IGF21參與某些纖維化疾病(如肺纖維化[13,16]、肝纖維化[8])的發(fā)生發(fā)展,而TGF2 β1作為機(jī)體不可或缺的多功能細(xì)胞生長(zhǎng)因子,在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面起重要作用[36]。研究證實(shí),纖維化是一類免疫介導(dǎo)的疾病,固有免疫和適應(yīng)性免疫均參與其中[36]。目前,IGF21與TGF2 β1在骨骼肌纖維化的形成過程中的作用尚未完全闡明,二者的作用是相互獨(dú)立的、拮抗的還是相互協(xié)同的?本研究通過建立骨骼肌纖維化動(dòng)物模型,對(duì)骨骼肌纖維化形成過程中IGF21、TGF2 β1的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行同步研究,分析二者的表達(dá)分布特征、表達(dá)面積百分比、表達(dá)強(qiáng)度特征,為深入理解骨骼肌纖維化的發(fā)生機(jī)制,從而防治骨骼肌纖維化以及其他纖維化疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康雄性Sprague2Dawley(SD)大鼠(180～220 g)54只,由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將54只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(6只)和模型組(48只)。模型組根據(jù)取材時(shí)間點(diǎn)的不同,進(jìn)一步分為:損傷后第1、2、3、7、14、21、28天組,每組各6只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立動(dòng)物模型

羅麗等[7]的研究表明,大鼠骨骼肌鈍挫傷自然愈合過程中,可出現(xiàn)典型的骨骼肌纖維化。本研究沿用其方法,建立骨骼肌纖維化動(dòng)物模型。

大鼠分籠飼養(yǎng)2天后,參照Kami等[21]的方法對(duì)大鼠實(shí)施骨骼肌鈍挫傷,即2.5%戊巴比妥鈉(0.2/100 mL/g)腹腔注射麻醉后,將大鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位置,用自制打擊裝置從81 cm高處自由垂直落下打擊動(dòng)物左小腿內(nèi)側(cè)面距跟骨1.5 cm處,重力為3.234 N,動(dòng)能為2.62 J,打擊面積約0.785 cm2。解剖證實(shí)后下肢肌群造模成功率達(dá)100%。

1.2.2 標(biāo)本取材及處理

先稱取動(dòng)物體重,用2.5%戊巴比妥鈉(0.2/100 mL/g)腹腔注射麻醉動(dòng)物后,速取損傷區(qū)域腓腸肌,用冰生理鹽水洗去殘留血液,中性福爾馬林固定,用于蘇木素2伊紅(hemotoxylin and erosin,HE)染色、膠原纖維范吉森(Van Gieson,V.G.)染色光鏡觀察和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 V.G.染色

V.G.染色法是用來顯示區(qū)分膠原纖維和肌纖維的優(yōu)良染色方法。特點(diǎn)是利用酸性品紅與苦味酸分別對(duì)膠原纖維、肌纖維具有較強(qiáng)親和力的原理,將其雙重染色,結(jié)果膠原纖維在酸性品紅的作用下染成紅色至粉紅色,肌肉在苦味酸的作用下染成黃色[30]。

1.2.4 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

小鼠抗大鼠IGF21、TGF2 β1多克隆抗體(Santacruz公司產(chǎn)品)、鼠兩步法檢測(cè)試劑盒(包括內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠多聚體),DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用常規(guī)2步免疫組化法,按試劑盒說明書操作。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,工作濃度均為1∶50。

使用Image Proplus 6.0顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色的切片進(jìn)行定量分析[27]。具體操作為低倍鏡(100 ×)下每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野測(cè)量,測(cè)定視野內(nèi)陽性面積百分比、陽性信號(hào)積分光密度(Integrated optical density, IOD)。陽性面積百分比指陽性表達(dá)區(qū)域面積占該視野觀察區(qū)域面積的百分比。積分光密度則反映光密度與面積的綜合變化,表示整個(gè)視野內(nèi)所有選定對(duì)象的反應(yīng)強(qiáng)度的總和。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件,方差分析(analysis of variance)法分析模型組與對(duì)照組IGF21、TGF2 β1陽性表達(dá)面積、陽性表達(dá)強(qiáng)度的差異。此外,采用有序樣品聚類分析方法對(duì)模型組IGF21、TGF2 β1陽性表達(dá)強(qiáng)度依時(shí)間發(fā)生的變化規(guī)律進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌纖維化模型的確立

HE染色結(jié)果可見:對(duì)照組:骨骼肌纖維排列整齊,無變性、出血、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原增生等改變。模型組:在損傷后第7天,損傷區(qū)域出現(xiàn)成纖維細(xì)胞;在損傷后21天,損傷區(qū)域肌纖維排列紊亂,可見膠原纖維增生(圖1);在損傷后第28天,膠原增生更加顯著。V.G.染色法進(jìn)一步清晰地顯示,損傷區(qū)域存在大量膠原纖維增生(圖2)。以上結(jié)果表明模型的建立是成功的。

圖1 模型組損傷后第21天HE染色光鏡下表現(xiàn)圖10×10Fig.1 Section of gastrocnemius muscle at the 21thday after contusion in the model group,stained with H&E

2.2 IGF2I的表達(dá)

2.2.1 IGF21表達(dá)的分布特征

對(duì)照組未見或偶見棕黃色染色陽性顆粒(圖3)。模型組IGF21染色均為陽性。模型組損傷后第1天,損傷區(qū)域IGF21陽性細(xì)胞呈彌漫性分布,棕黃色著色顆粒見于細(xì)胞漿,染色淺淡(圖4);損傷后第2天,模型組損傷區(qū)域出現(xiàn)片狀分布、染色深的IGF21陽性細(xì)胞(圖5);損傷后第3、7天的IGF21的表達(dá)分布與第2天相似(圖6、圖7);損傷后第14天,損傷區(qū)域再生肌細(xì)胞IGF21陽性染色強(qiáng)度增強(qiáng),出現(xiàn)大面積、片狀分布的棕褐色陽性細(xì)胞,且在肉芽組織,特別是新生的毛細(xì)血管處可見染色深的陽性顆粒(圖8);損傷后第21天與第14天相似(圖9);損傷后第28天,損傷區(qū)域再生的肌纖維呈現(xiàn)彌漫性陽性染色,此外,在增生的結(jié)締組織中可見呈條索狀分布的棕黃色顆粒(圖10)。

圖2 模型組損傷后第28天V.G.染色光鏡下表現(xiàn)圖10×10Fig.2 Section of gastrocnemius muscle at the 28thday after contusion in the model group,stained with V.G.

圖3 對(duì)照組IGF21表達(dá)圖10×10Fig 3. The expression of IGF21 in the control group

圖4 模型組損傷后第1天IGF21表達(dá)圖10×10Fig 4. The expression of IGF21 at the 1stday after contusion in the control group

圖5 模型組損傷后第2天IGF21表達(dá)圖10×10Fig.5 The expression of IGF21 at the 2ndday after contusion in the model group

圖7 模型組損傷后第7天IGF21表達(dá)圖10×10Fig.7 The expression of IGF21 at the 7thday after contusion in the model group

圖9 模型組損傷后第21天IGF21表達(dá)圖10×10Fig.9 The expression of IGF21 at the 21thday after contusion in the model group

圖10 模型組損傷后第28天IGF21表達(dá)圖10×10Fig.10 The expression of IGF21 at the 28thday after contusion in the model group

2.2.2 IGF21陽性面積百分比變化和陽性表達(dá)強(qiáng)度特征

損傷后模型組IGF21陽性面積百分比持續(xù)上升,與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01),峰值點(diǎn)在損傷后第28天(圖11);損傷后模型組IGF21陽性表達(dá)強(qiáng)度上調(diào),在損傷后第2、3、7、14、21、28天均顯著高于對(duì)照組(P<0.01),呈倒“V”字形變化,峰值點(diǎn)在損傷后第21天(圖12)。

圖11 對(duì)照組和模型組IGF21陽性面積的變化圖Fig.11 The change of IGF21 positive areas in thecontrol group and the model group

2.3 TGF2 β1的表達(dá)

2.3.1 TGF2 β1表達(dá)的分布特征

對(duì)照組和模型組TGF2 β1染色均為陽性。對(duì)照組棕褐色陽性顆粒主要分布于胞漿、肌膜。陽性細(xì)胞主要分布在肌束膜周圍,以連接部位著色最強(qiáng)(圖13)。模型組損傷后第1天,損傷區(qū)域肌細(xì)胞大量變性、壞死,陽性表達(dá)很少,而間質(zhì)陽性染色較強(qiáng),尤以炎性細(xì)胞浸潤(rùn)比較集中的區(qū)域?yàn)橹?圖14);損傷后第2天與第1天相似(圖15);損傷后第3天,損傷區(qū)域棕褐色陽性顆粒主要集中在細(xì)胞間質(zhì),肌細(xì)胞幾乎沒有陽性表達(dá)(圖16);損傷后第7天,損傷區(qū)域新生肌細(xì)胞和間質(zhì)均可見大量彌散性分布的棕黃色至棕褐色陽性顆粒(圖17);損傷后第14天,損傷區(qū)域再生肌組織可見呈片狀分布的陽性細(xì)胞,著色深淺不一,細(xì)胞間質(zhì)可見棕褐色、條索狀分布的陽性表達(dá)(圖18);損傷后第21天與第14天相似(圖19);損傷后第28天,損傷區(qū)域肌再生肌纖維仍可見呈片狀分布的陽性細(xì)胞,增生的結(jié)締組織可見較多棕褐色顆粒,染色較深(圖20)。

圖12 對(duì)照組和模型組IGF21表達(dá)陽性強(qiáng)度變化圖Fig.12 The expression intensity of IGF21 in the control group and the model group

圖13 對(duì)照組TGF2 β1表達(dá)圖10×10Fig 13. The expression of TGF2 β1 in the control group

圖14 模型組損傷后第1天TGF2 β1表達(dá)圖10×10Fig 14. The expression of TGF2 β1 at the 1stday after contusion in the model group

圖15 模型組損傷后第2天TGF2 β1表達(dá)圖10×10Fig 15. The expression of TGF2 β1 at the 2ndday after contusion in the model group

圖16 模型組損傷后第3天TGF2 β1表達(dá)圖10×10Fig 16. The expression of TGF2 β1 at the 3rdday after contusion in the model group

圖17 模型組損傷后第7天TGF2 β1表達(dá)圖10×10Fig 17. The expression of TGF2 β1 at the 7thday after contusion in the model group

圖18 模型組損傷后第14天TGF2 β1表達(dá)圖10×10Fig 18.The expression of TGF2 β1 at the 14thday after contusion in the model group

圖19 模型組損傷后第21天TGF2 β1表達(dá)圖10×10Fig 19.The expression of TGF2 β1 at the 21thday after contusion in the model group

圖20 模型組損傷后第28天TGF2 β1表達(dá)圖10×10Fig 20.The expression of TGF2 β1 at the 28thday after contusion in the model group

2.3.2 TGF2 β1陽性面積百分比、陽性強(qiáng)度的變化

各模型組陽性面積百分比均顯著高于對(duì)照組(損傷后第1、2、14、21、28天,P<0.01;損傷后第3、7天,P< 0.05)。各模型組陽性強(qiáng)度變化趨勢(shì)與陽性面積百分比變化趨勢(shì)基本一致,呈現(xiàn)“V”字形變化,在損傷后各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(損傷后2、21、28天,P<0.01,損傷后第3、7、14天,P<0.05)(圖21、圖22)。TGF2 β1表達(dá)強(qiáng)度的峰值點(diǎn)在損傷后第28天。

圖21 對(duì)照組和模型組TGF2 β1陽性面積百分比的變化圖Fig.21 The change of TGF2 β1 positive areas in the control group and the model group

2.4 模型組IGF21、TGF2 β1陽性表達(dá)強(qiáng)度變化的有序樣品聚類分析

有序樣品聚類分析,也稱為最優(yōu)分割法,在分類時(shí)不打亂樣品序號(hào)的次序,即同一類樣品的序號(hào)必須是相互連接的,并比較所有可能的分類結(jié)果,在某種損失函數(shù)意義下,求得最優(yōu)解(即要求分類后產(chǎn)生的總的組內(nèi)離差平方和最小),使得組內(nèi)相似性大,而組間相似性小[2]。用有序樣品聚類分析法對(duì)依時(shí)間次序排列的樣本進(jìn)行分類,可以精確地劃分指標(biāo)變化的不同時(shí)期。根據(jù)IGF21、TGF2 β1陽性表達(dá)強(qiáng)度(IOD)測(cè)定結(jié)果,用有序樣品聚類分析法研究了它們的階段變化情況。

圖22 對(duì)照組和模型組TGF2 β1陽性表達(dá)強(qiáng)度的變化圖Fig.22 The expression intensity of TGF2 β1 in the control group and the model group

模型組IGF21、TGF2 β1陽性表達(dá)強(qiáng)度IOD測(cè)定結(jié)果見表1、表2。有序樣品聚類分析的具體計(jì)算步驟如下: 1)計(jì)算樣本的類直徑,結(jié)果見表3、表4;2)由類直徑表和分類損失函數(shù)的遞推公式計(jì)算最小分類損失函數(shù),結(jié)果見表5、表6。3)根據(jù)最小分類損失函數(shù)對(duì)分類數(shù)的變化情況確定分為三類,并確定出各類的邊界樣品號(hào),可得最后分類結(jié)果為:IGF21:{1,2,3,4}{5,6}{7};TGF2 β1{1, 2}{3,4,5}{6,7}。于是得到了模型組IGF21變化的3個(gè)分期:損傷后第1～7天為第1期,損傷后第14～21天為第2期,損傷后第28天為第3期(第8～13天以及第22～27天有待進(jìn)一步劃定)。模型組TGF2 β1變化也分為3個(gè)時(shí)期:損傷后第1～2天為第1期,損傷后第3～14天為第2期,損傷后第21～28天為第3期(第15～20天有待進(jìn)一步劃定)。

分析中用到的概念與公式[2]:

樣本的類直徑:設(shè)一維有序樣品依次為X(1),X(2),∧,X(n)。

設(shè)某一類G包含的樣品有{X(i),X(i+1),∧,X(j)}(j>i),記為G=(i,i+1,∧,j)。該類的均值為規(guī)定直徑為D(i,j)

分類損失函數(shù):用b(n,k)表示將n個(gè)有序樣品分為k類的某一種分法:G1={i1,i1+1,∧,i2-1},G2={i2,i2+ 1,∧,i3-1},…,Gk={ik,ik+1,∧,n},其中分點(diǎn)為1=i1

當(dāng)n,k固定時(shí),記P(n,k)是使上式達(dá)到最小的分類法。

最小分類損失函數(shù)的遞推公式:

表1 模型組IGF21表達(dá)陽性強(qiáng)度(IOD)變化一覽表Table 1 The change of IGF21 expression intensity(IOD)in the model group

表2 模型組TGF2 β1表達(dá)陽性強(qiáng)度(IOD)變化一覽表Table 2 The TGF-β1 expression intensity(IOD)in the model group

表3 IGF21(IOD)類直徑D(i,j)一覽表Table 3 The class diameterD(i,j)of IGF21(IOD)

表4 TGF2 β1(IOD)類直徑D(i,j)一覽表Table 4 The class diameterD(i,j)of TGF2 β1(IOD)

表5 IGF21(IOD)最小分類損失函數(shù)L[P(l,k)]一覽表Table 5 The minimum classification loss functionL[P(l,k)]of IGF21(IOD)

表6 TGF2 β1(IOD)最小分類損失函數(shù)L[P(l,k)]一覽表Table 6 The minimum classification loss functionL[P(l,k)]of TGF2 β1

3 討論

本研究采用急性鈍挫傷的方式建立了骨骼肌纖維化動(dòng)物模型,HE和V.G.染色結(jié)果證實(shí),模型的建立是成功的。

骨骼肌的再生與修復(fù)是包括骨骼肌細(xì)胞再生與細(xì)胞外間質(zhì)再生的非常復(fù)雜的過程,其間多種細(xì)胞信號(hào)通路被激活[12,19,33,35]。傳統(tǒng)上,將骨骼肌損傷與修復(fù)的過程分為損傷期、修復(fù)期、組織塑型期3個(gè)階段[20]。損傷期發(fā)生在損傷后的最初幾天,主要表現(xiàn)有肌肉壞死、退化,中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),巨噬細(xì)胞游弋到損傷處吞噬壞死組織;修復(fù)期通常發(fā)生在受損后的7～10天,其高峰通常發(fā)生在受傷后2周左右,在受傷后3～4周下降,在這一階段,主要發(fā)生肌組織和細(xì)胞外基質(zhì)的再生;組織塑型期通常在受傷后第2～3周開始,主要的病理變化是:再生骨骼肌成熟,瘢痕組織機(jī)化。一旦疤痕形成,肌組織的完全修復(fù)將不可能發(fā)生。

關(guān)于骨骼肌纖維化發(fā)生的過程中IGF21、TGF2 β1動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的研究很少,這在很大程度上制約著對(duì)骨骼肌纖維化的深入理解。本研究選取骨骼肌纖維化形成過程中的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)(損傷期選取損傷后第1、2、3天;修復(fù)期選取損傷后第7、14天;組織塑型期選取第21、28天),對(duì)IGF21、TGF2 β1的表達(dá)分布特征、表達(dá)陽性面積百分比、表達(dá)強(qiáng)度特征進(jìn)行同步研究,并采用有序樣品聚類分析的方法,對(duì)骨骼肌纖維化形成過程中IGF21、TGF2 β1表達(dá)強(qiáng)度的變化規(guī)律進(jìn)行研究,為骨骼肌纖維化的預(yù)防和治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究結(jié)果表明,骨骼肌損傷發(fā)生后,IGF21在損傷區(qū)域的表達(dá)分布持續(xù)增加,IGF21陽性面積百分比的峰值點(diǎn)在損傷后第28天;有序樣品聚類分析的結(jié)果表明,模型組IGF21表達(dá)強(qiáng)度的變化呈現(xiàn)倒“V”形,分為3個(gè)時(shí)期:損傷后第1～7天為第1期,損傷后第14～21天為第2期,損傷后第28天為第3期,其中第2期最高。模型組損傷后IGF21表達(dá)均顯著高于對(duì)照組,其中在第2期表達(dá)最高。近年來的研究證實(shí),骨骼肌損傷修復(fù)過程中IGF21表達(dá)上調(diào),但關(guān)于損傷后IGF21的變化規(guī)律國(guó)內(nèi)外均少有報(bào)道。李云霞等[4]采用逆轉(zhuǎn)錄2聚合酶鏈反應(yīng)(RT2PCR)方法,研究了SD大鼠骨骼肌鈍挫傷后組織修復(fù)過程中(損傷后第1、2、3、4、6、9、14天)局部IGF21 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),IGF2I mRNA含量在傷后2、3、4、6、9、14天升高。李宏云等[3]采用打擊裝置造成大鼠右側(cè)腓腸肌中段鈍挫傷模型,采用Western blot方法對(duì)IGF21多肽表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,在損傷后第4、7、14、28天,IGF21多肽表達(dá)均明顯升高(P<0.05)。以上研究均說明,IGF21表達(dá)的啟動(dòng)是損傷修復(fù)過程中長(zhǎng)期持續(xù)的過程,但在這些研究中,時(shí)間點(diǎn)的選擇相對(duì)較少,也未對(duì)損傷后各期的變化趨勢(shì)進(jìn)行深入分析。

在本研究中,模型組IGF21表達(dá)強(qiáng)度的變化呈現(xiàn)倒“V”形,并可區(qū)分為不同水平的3個(gè)階段,這是否意味著IGF21在損傷修復(fù)的不同階段可能起著不同的作用?羅麗等[6]對(duì)大鼠急性骨骼肌鈍挫傷后肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖規(guī)律的研究表明,肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖在損傷后第1天出現(xiàn),在損傷后第3天達(dá)到高峰,損傷后第7天已下降至略高于損傷后第2天的水平,損傷后第14天,損傷肌組織中肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核偶見,損傷后第21、28天,PCNA表達(dá)為陰性。因此,我們推測(cè),在損傷后第1～7天,IGF21的主要作用是促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增生、分化,在損傷后第14～21天,肌衛(wèi)星細(xì)胞增生、分化已經(jīng)完成,此期主要發(fā)生新生肌纖維體積增大,在這一階段,IGF21的主要作用是通過促進(jìn)肌纖維增加蛋白和DNA合成[12,35],從而促進(jìn)新生肌纖維進(jìn)一步成熟。但是,在骨骼肌損傷修復(fù)的后期(塑型期),肌衛(wèi)星細(xì)胞的增生、分化已經(jīng)完成,適度的IGF21可促進(jìn)新生骨骼肌纖維的成熟,但如果IGF21表達(dá)失控,或在此階段過量使用IGF21,除了誘發(fā)肌肉肥大,還可能誘導(dǎo)膠原纖維的過度增生。有證據(jù)表明,IGF21作為一種生長(zhǎng)因子,參與肺纖維化[13,16]、肝纖維化[8]的形成,在肌腱損傷的修復(fù)[15]以及腰椎退變[5]等的發(fā)生過程中,能促進(jìn)膠原合成。筆者認(rèn)為,IGF21雖然是促進(jìn)骨骼肌再生的主要生長(zhǎng)因子,但其在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)膠原再生方面的作用亦不容忽視,可能對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖也起促進(jìn)作用。在本研究中, IGF21的陽性面積百分比呈現(xiàn)持續(xù)增加,在損傷后第28天達(dá)到高峰,并且大量地分布于增生的結(jié)締組織;此外, IGF21表達(dá)強(qiáng)度在第3期也處于相當(dāng)高的水平,因此,筆者認(rèn)為,骨骼肌纖維化的形成與組織塑型期IGF21的過度表達(dá)有密切關(guān)系。

TGF2 β1在體內(nèi)能調(diào)節(jié)多種組織的生物學(xué)過程,其最終效應(yīng)受到細(xì)胞間微環(huán)境的控制。在骨骼肌發(fā)育的過程中,TGF2 β1能調(diào)節(jié)成肌發(fā)生,阻止成肌細(xì)胞過早分化,幫助發(fā)育肌肉的正常形成[22]。本研究結(jié)果顯示,TGF2 β1在正常青年大鼠肌組織中也有表達(dá),棕褐色陽性顆粒主要分布于胞漿、肌膜。陽性細(xì)胞主要分布在肌束膜周圍,以連接部位著色最強(qiáng)。這表明TGF2 β1在維持正常肌組織的代謝方面起作用(可能與肌內(nèi)膜、肌束膜處I型、III型膠原纖維的表達(dá)有關(guān))。

模型組損傷后各時(shí)間點(diǎn)TGF2 β1表達(dá)均顯著高于對(duì)照組,呈現(xiàn)“V”字形變化,TGF2 β1表達(dá)強(qiáng)度的峰值點(diǎn)在損傷后第28天。有序樣品聚類分析結(jié)果表明,模型組TGF2 β1變化也分為3個(gè)時(shí)期:損傷后第1～2天為第1期,損傷后第3～14天為第2期,損傷后第21～28天為第3期,其中第2期最低。在損傷后第1～2天,損傷區(qū)域肌細(xì)胞大量變性、壞死,TGF2 β1陽性表達(dá)主要出現(xiàn)在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)比較集中的區(qū)域(圖14、圖15)。研究表明,無論是離心收縮、毒素注射還是擠壓傷動(dòng)物模型,均發(fā)現(xiàn)在骨骼肌損傷后的48 h內(nèi),TGF2 β1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上升[34]。骨骼肌損傷后的炎癥反應(yīng)是修復(fù)不可或缺的重要階段,其中主要包括巨噬細(xì)胞、TGF2 β1和COX22信號(hào)通路的參與[32]。Shen W等[32]的研究表明,清除巨噬細(xì)胞將導(dǎo)致骨骼肌再生下降,而TGF2 β1促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),這一效應(yīng)是通過COX22信號(hào)通路介導(dǎo)的。新型凋亡分子TNF2like weak in2 ducer of apoptosis(TWEAK)是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的促炎性細(xì)胞因子,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激活激酶21(TGF2 βactivated kinase 1, TAK1)是TGF2 β1的下游因子,Kumar M等[23]的研究表明,TAK1是TWEAK誘導(dǎo)的促炎性信號(hào)通路和基因表達(dá)的重要成分。因此,筆者認(rèn)為,在損傷修復(fù)的早期階段, TGF2 β1是參與炎癥反應(yīng)的重要因子,其適度表達(dá)有助于肌肉再生。

損傷后第3～14天,模型組TGF2 β1的表達(dá)強(qiáng)度低于損傷后第1～2天,但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。以往的研究認(rèn)為,TGF2 β1是強(qiáng)大的負(fù)性肌肉再生調(diào)節(jié)因子[12,19],能誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞[25],是骨骼肌纖維化的始動(dòng)因子。但TGF2 β1在修復(fù)期再生肌細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)上調(diào),除了與細(xì)胞外間質(zhì)的再生有關(guān)以外,是否與骨骼肌細(xì)胞的分化有關(guān)?Bhatnagar S等[10]的研究支持我們的觀點(diǎn)。Bhatnagar S等[10]發(fā)現(xiàn),TGF2 β1的下游因子TAK1在增生的C2C12成肌細(xì)胞中表達(dá),其水平在成肌細(xì)胞分化為肌管的過程中下降。TAK1負(fù)性基因突變或敲除能抑制C2C12成肌細(xì)胞的增生和分化。敲除TAK1也抑制MyoD誘導(dǎo)的小鼠胚胎纖維母細(xì)胞向肌管的轉(zhuǎn)化。抑制TAK1能下調(diào)肌細(xì)胞分化相關(guān)的P38有絲分裂原激活的蛋白激酶(mitogen2activated protein kinase,AMPK)和蛋白激酶Akt。TAK1也參與IGF21誘導(dǎo)的成肌分化?？傊?Bhatnagar S等[10]的結(jié)果提示,TAK1是骨骼肌細(xì)胞分化的重要的上游調(diào)節(jié)因子,是分化的成肌細(xì)胞表達(dá)成肌調(diào)節(jié)因子必需的。因此,筆者認(rèn)為,在損傷后第3～14天, TGF2 β1的表達(dá)上升可能與其參與成肌分化有關(guān)。

在本研究中,筆者觀察到,在損傷區(qū)域新生肌細(xì)胞和間質(zhì)均可見大量棕黃色至棕褐色TGF2 β1陽性顆粒(圖17、18、19、20),并且間質(zhì)的陽性表達(dá)逐漸由彌散性分布轉(zhuǎn)為條索狀分布。骨骼肌損傷的康復(fù)除了包括骨骼肌細(xì)胞的再生以外,還包括細(xì)胞外間質(zhì)的再生與修復(fù)。推測(cè), TGF2 β1在損傷后細(xì)胞外間質(zhì)的修復(fù)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用,并主要與I型膠原的增生有關(guān)(I型膠原呈致密的長(zhǎng)束狀[18])。但在損傷后第21～28天,細(xì)胞外間質(zhì)的修復(fù)已基本完成,若此時(shí)發(fā)生TGF2 β1過度表達(dá),將導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)膠原纖維增生,引發(fā)纖維化和疤痕形成。在本研究中,損傷后第21～28天TGF2 β1的表達(dá)分布百分比處于高水平,并且在增生的結(jié)締組織大量表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度則在第3期持續(xù)增加,并在損傷后第28天達(dá)到高峰,這表明,在組織塑型期,可能存在TGF2 β1的過度表達(dá)。

根據(jù)以上分析,本研究結(jié)果部分地解釋了外源性IGF2 1或IGF21轉(zhuǎn)基因靶向治療、抑制TGF2 β1激活的信號(hào)通路等療法的副作用的發(fā)生原因,為深入認(rèn)識(shí)IGF21、TGF2 β1在骨骼肌損傷修復(fù)過程中的作用與機(jī)制提供了新的思路。

4 結(jié)論

IGF21、TGF2 β1在骨骼肌纖維化形成過程中均高水平表達(dá),二者共同參與骨骼肌損傷的修復(fù)過程,但在損傷過程的不同時(shí)相,二者可能分別起著不同的作用:在損傷期和修復(fù)期,二者可能共同參與骨骼肌再生和細(xì)胞外基質(zhì)再生,并且可能存在協(xié)同作用;在組織塑型期,IGF21、TGF2 β1均高水平表達(dá)于細(xì)胞間質(zhì)(特別是增生的結(jié)締組織),二者可能共同參與了骨骼肌纖維化的形成。

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The Expression of IGF21 and TGF2 β1
in the Formation of Rat Skeletal Muscle Fibrosis

LUO Li1,ZHANG Jian2,DONG Yu3,SUN Zhong2wen4,
LI Xiao2ning4,LU A2ming1,LIU Cheng2yi5

G804.7

A

2011207225;

2011210220

國(guó)家自然科學(xué)基金(60878061),蘇州市體育局局管課題(TY220102101)資助。

羅麗(19752),女,安徽人,博士,副教授,碩士研究生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué),E2mail:luoli@suda.edu. cn。

11蘇州大學(xué)體育學(xué)院,江蘇蘇州215021;21蘇州大學(xué)

數(shù)學(xué)科學(xué)學(xué)院,江蘇蘇州215006;31復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科,上海200040;41蘇州市衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇蘇州215104;51華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院和民族體質(zhì)與健康研究中心,廣東廣州510006

11School of Physical Education and Sports Science,Soo2 chow University,Suzhou 215021,China;21School of Methematics,SoochowUniversity,Suzhou 215006, China;31Department of Orthopaedics and Sports Medi2 cine,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China;41Suzhou Health College of Vocational Technology,Suzhou 215104,China;51College of Sports Science and Research Center of Nationalistic Constitu2 tion and Health,South China Normal University,Guang2 zhou 510006,China.

圖8 模型組損傷后第14天IGF21表達(dá)圖10×10

Fig.8 The expression of IGF21 at the 14thday after contusion in the model group

Abstract:Objective:To investigate IGF21 and TGF2 β1 simultaneously dynamic changes during the formation of the skeletal muscle fibrosis,aims to in2depth understanding of the mechanism of skeletal muscle fibrosis,and a theoretical and experimental basis for the prevention of fibrot2 ic diseases.Methods:54 male SD rats(180～220 g)were randomly divided into control group (n=6)and model group(n=48).Model group,according to the different sampling time points,were further divided into:1,2,3,7,14,21,28 days after injury group(n=6).Acute skeletal muscle contusions were made using a blunt object in the rats of model group.Immuno2 histochemistry technique was used to investigate the expression of IGF21 and TGF2 β1 during the formation of skeletal muscle fibrosis.Sequential Sample Cluster Analysis was used to divide the changes into different phases.Results:1)The expression IGF21 in the injured region in model group increased continually.Besides in the regenerative muscle fibers,IGF21 could be seen in granular tissue and connective tissue,especially during the fibrotic period.The expres2 sion intensity of IGF21 in the model group showed a reverse“V”shape,and could be divided into three phases:phase 1:from the 1st to 7th day after injury;phase 2:from the 14th day to the 21st day after injury;phase 3:the 28th day after injury.2)The expression of TGF2 β1 in the injured region in model group increased significantly,TGF2 β1 expression could be seen both in the newborn muscle cells and the intracellular substance.The expression intensity of TGF2 β1 could showed“V”shape change and also be divided into three phases:phase 1:from the 1st to the 2nd day after injury for,phase 2:from the third to the 3rd to 14th day after in2 jury;phase 3:from 21st to 28th day after injury.Conclusion:Both IGF21 and TGF2 β1 in2 creased during the process of skeletal muscle fibrosis,they could play different roles in the dif2 ferent phases during the repair process of skeletal muscle injury.Both IGF21 and TGF2 β1 were expressed in extracellular substance(especially in the fibrotic tissue),which indicated that theywere both involved in the formation of skeletal muscle fibrosis.

Key words:skeletal muscle f ibrosis;insulin2like growth f actor21;transf orming growth f ac2 tor2 β1