安 楠

運(yùn)動(dòng)對(duì)成長(zhǎng)期骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭N乙酰膽堿受體表達(dá)的影響

安 楠

研究目的:通過(guò)分析骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)N乙酰膽堿受體(nAChR)亞基在成長(zhǎng)期(離乳-性成熟)的表達(dá)特征,了解NMJ發(fā)育過(guò)程中的變化及運(yùn)動(dòng)對(duì)這一過(guò)程的影響。研究方法:對(duì)3周齡SD雄性大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)(跑臺(tái)運(yùn)動(dòng))和運(yùn)動(dòng)減弱(尾部懸吊)干預(yù),測(cè)定γ-、ε-、δ-nAChR m RNA在3～8周齡的表達(dá)水平。結(jié)果:1)大鼠腓腸肌γ-、ε-、δ-nAChR的表達(dá)水平在出生后3～5周迅速下降,至5周齡時(shí)僅有微量的表達(dá);2)懸吊組γ-nAChR在5周齡時(shí)表達(dá)水平高于對(duì)照組;運(yùn)動(dòng)組γ-nAChR在8周齡時(shí)表達(dá)水平低于對(duì)照組;3)ε-和δnAChR表達(dá)水平在組間無(wú)顯著性差異。結(jié)論:骨骼肌NMJ的發(fā)育在出生后早期具有典型的敏感期;運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以促進(jìn)胚胎型γ-nAChR的消退,限制運(yùn)動(dòng)則顯著延緩這一過(guò)程;成熟后的NMJ具有一定的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

運(yùn)動(dòng);神經(jīng)肌肉接頭;成長(zhǎng)期;發(fā)育;N乙酰膽堿受體亞基;鼠;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1 前言

N型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)是哺乳動(dòng)物骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction,NMJ)與神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)結(jié)合、完成神經(jīng)肌肉信號(hào)傳遞的重要結(jié)構(gòu),由5種亞基組成,其中的α亞基是與ACh結(jié)合的部位。nAChR在發(fā)育的過(guò)程中需要完成由胚胎型(α2βγδ)向成熟型(α2βεδ)的轉(zhuǎn)換,由ε亞基替代γ亞基,從而實(shí)現(xiàn)功能成熟[1]。γ-ε轉(zhuǎn)換并非是nAChR形成所必須的,但對(duì)保持終板結(jié)構(gòu)高度集中很關(guān)鍵[14]。研究發(fā)現(xiàn),嚙齒動(dòng)物的這個(gè)過(guò)程主要在出生后的幾周內(nèi)完成,與NMJ由多神經(jīng)支配向單神經(jīng)支配的轉(zhuǎn)化時(shí)間一致,成熟型nAChR集中地表達(dá)在已經(jīng)具有胚胎型nAChR的運(yùn)動(dòng)終板上,然后逐漸取代胚胎型nAChR[17]。關(guān)于γ-ε亞基置換過(guò)程的調(diào)節(jié)機(jī)制,神經(jīng)源性Agrin、肌特異性酪氨酸激酶Musk以及Rapsyn,已知在其中扮演核心角色[12]。NMJ作為神經(jīng)突觸的一種,其形成、發(fā)育和功能完善的過(guò)程均與神經(jīng)肌肉運(yùn)動(dòng)功能有關(guān)。

關(guān)于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是否會(huì)改變NMJ突觸結(jié)構(gòu)成分,不少學(xué)者持否定意見(jiàn)。Herscovich S等人[7]認(rèn)為,10周耐力運(yùn)動(dòng)可以阻止膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphnicol acetyltransferase,CAT)及乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,ACh E)活性的增齡性降低,但卻無(wú)法增加nAChR的數(shù)量。Lynch G. S.等人[10]也提出,運(yùn)動(dòng)后nAChR、AChE和CAT均無(wú)變化。也有觀點(diǎn)認(rèn)為,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢和NMJ結(jié)構(gòu)成分可以對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)生適應(yīng)性變化,耐力訓(xùn)練可以改變NMJ突觸后膜nAChR的數(shù)目,提出運(yùn)動(dòng)對(duì)NMJ的影響主要表現(xiàn)在nAChR數(shù)量和AChE活性的變化[3],伴隨于NMJ傳遞效率的電生理學(xué)變化。Desaulniers P[4]等則發(fā)現(xiàn),16周耐力訓(xùn)練可以使不同肌肉運(yùn)動(dòng)終板nAChR的數(shù)目增加,從而改變nAChR的密度,這種作用是NMJ對(duì)長(zhǎng)期耐力訓(xùn)練產(chǎn)生的適應(yīng)性改變,同時(shí)受nAChR代謝狀態(tài)的調(diào)節(jié)。另外,對(duì)NMJ超微結(jié)構(gòu)的研究表明,小強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間的跑臺(tái)訓(xùn)練可以使突觸前活動(dòng)區(qū)密度、突觸后膜nAChR密度增加,從而使量子釋放增加,并有足夠的nAChR與之結(jié)合,在高突觸功能水平上維持突觸傳遞[16]。以上的研究主要針對(duì)運(yùn)動(dòng)對(duì)成年期NMJ的影響,以及通過(guò)NMJ染色和圖像分析推斷nAChR的變化情況,對(duì)于nAChR的分子水平變化以及對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)育更為敏感的成長(zhǎng)期關(guān)注較少。

本研究通過(guò)測(cè)定大鼠腓腸肌中nAChR部分亞基在出生后3～8周的表達(dá)情況,判斷骨骼肌NMJ發(fā)生γ-ε亞基置換的時(shí)間,從分子水平研究成長(zhǎng)期腓腸肌NMJ結(jié)構(gòu)發(fā)育的特征以及運(yùn)動(dòng)對(duì)這一過(guò)程的作用,從而豐富早期發(fā)展運(yùn)動(dòng)能力的基礎(chǔ)理論。

2 研究對(duì)象和方法

2.1 研究對(duì)象

出生18天的Sprague-Daw ley(SD)雄性大鼠130只,隨機(jī)分為對(duì)照組(Control Group,C組)、運(yùn)動(dòng)組(Training Group,T組)和懸吊組(Hanging Group,H組),對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng);運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),運(yùn)動(dòng)負(fù)荷從8 m/min、20 min/d開(kāi)始,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間交替增加,至8周時(shí)達(dá)42 m/min、60 min/d,每天運(yùn)動(dòng)1次,每周運(yùn)動(dòng)6天;懸吊組采用尾部懸吊造成后肢懸空去負(fù)荷。對(duì)照組在3周齡時(shí)取材一次,各組在達(dá)4周齡、5周齡、6周齡、8周齡分別取材,按0.3 m l/100 g體重劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉,迅速分離出腓腸肌于預(yù)冷的生理鹽水中漂洗,濾紙吸干,置液氮速凍待測(cè)。

2.2 研究方法

主要儀器和試劑:Takara TP600型梯度PCR儀(日本); SLAN雙通道熒光定量PCR儀(上海);JY-SP-B型電泳槽(北京);JY02S型凝膠紫外分析儀(北京);Mylab通用型RNA快速提取試劑盒(美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司,中國(guó)); M-M uLV反轉(zhuǎn)錄酶:200 U/μl,Fermentas(MBI公司,美國(guó));RNase Inhibitor:40 U/μl,Fermentas(MBI公司,美國(guó))。

引物設(shè)計(jì):所有引物均先由GNEBANK查詢m RNA序列,用Primer軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 ε-AChR、δ-AChR和γ-AChRm RNA引物序列一覽表Table 1 Primers ofε-AChR,δ-AChRandγ-AChRm RNA

組織RNA的提取:從液氮中取出腓腸肌組織約0.1 g,迅速放入液氮預(yù)冷的研缽中,加入液氮充分研磨至粉末狀;加入1 m l RNA提取液,充分混合,室溫放置成溶液,最后加入50μl無(wú)RNase的水,溶解RNA。加氯仿0.25 m l,混勻,13 000 rpm離心5 min后,吸取上清750μl,加等體積異丙醇-20℃沉淀核酸,離心取沉淀,75%乙醇洗滌,加DEPC水溶解。用DNase I消化樣品RNA中的DNA(表2)。

反轉(zhuǎn)錄(25μl反應(yīng)體系):取RNA樣品3μg,加Oligo Dt T18(50M)2.5μl,加DEPC水至25μl,混勻。70℃5 min,立即冰浴,然后在反應(yīng)體系中依次加入5×buffer 8μl,dNTP(10 mM)4μl,RNase Inhibitor(MBI)1μl,混勻, 37℃5 min;再加入M-MuLV(MBI)2μl,于42℃60 min, 70℃10 min。

表2 DNA消化步驟一覽表Table 2 Procedure of DNase digestion

PCR檢測(cè):向PCR管中分別加入不含染料2×qPCR TaqMix 12.5μl,10μM各基因正反向引物混合物0.5μl,對(duì)應(yīng)的cDNA各1μl,其中一管不加模板用作陰性對(duì)照,各管補(bǔ)加水至25μl。混勻,置于SLAN熒光定量PCR儀中。95℃5 min,55℃15 s,65℃35 s(熒光檢測(cè)),40循環(huán),獲得擴(kuò)增曲線。

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示;用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行One-way ANOVA比較均值,顯著性水平取P<0.05,非常顯著性水平取P<0.01。

3 研究結(jié)果

圖1、圖3對(duì)γ-、ε-、δ-nAChR亞基在運(yùn)動(dòng)干預(yù)下同周齡不同組間的表達(dá)情況進(jìn)行了橫向比較。

表3 對(duì)照組3～8周齡大鼠腓腸肌γ-、ε-、δ-nAChR亞基m RNA相對(duì)表達(dá)量一覽表(n=8)Table 3 Relative expressions ofγ-、ε-、δ-nAChRmRNA in gastrocnem ius of 3～8-week-old SD rats in control group

表4 運(yùn)動(dòng)組3～8周齡大鼠腓腸肌γ-、ε-、δ-nAChR亞基m RNA相對(duì)表達(dá)量一覽表(n=8)Table 4 Relative expressions ofγ-、ε-、δ-nAChRmRNA in gastrocnem ius of 3～8-week-old SD rats in train ing group

表5 懸吊組3～8周齡大鼠腓腸肌γ-、ε-、δ-nAChR亞基m RNA相對(duì)表達(dá)量一覽表(n=8)Table 5 Relative expressions ofγ-、ε-、δ-nAChRm RNA in gastrocnemius of 3～8-week-old SD rats in hanging group

圖1 正常發(fā)育及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下3～8周齡大鼠腓腸肌γ-nAChRmRNA表達(dá)情況折線圖(n=8)Figure 1 Expressions ofγ-nAChRm RNA in gastrocnemius of 3～8-week-old SD rats(compared between groups,n=8)

4 討論

大鼠出生后3～8周齡處于從斷乳到性成熟的成長(zhǎng)期,本研究檢測(cè)了大鼠骨骼肌γ-、ε-和δ-三種nAChR亞基在這一時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),骨骼肌nAChR在成長(zhǎng)期的表達(dá)具有一定的規(guī)律:γ-、ε-和δ-nAChR亞基在出生后3周時(shí)均處于較高的表達(dá)水平,之后迅速下降(P< 0.01),至5周齡時(shí)基本不表達(dá),三種亞基的下降趨勢(shì)相似(圖1～圖3),這與現(xiàn)有的一些研究結(jié)果相似[5,9]。nAChR亞基的表達(dá)始于胚胎期,作為胚胎型NMJ的特征性成分, γ-亞基的表達(dá)開(kāi)始最早,以保證胚胎期nAChR的大量廣泛聚集[8],而ε-亞基則相反,其表達(dá)開(kāi)始于神經(jīng)支配形成之后,遠(yuǎn)遠(yuǎn)晚于其他亞基開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的時(shí)間,說(shuō)明其表達(dá)是受神經(jīng)支配誘導(dǎo)的[11]。出生后發(fā)生的γ-ε置換過(guò)程應(yīng)該不是一種亞基消失之后另一種亞基才開(kāi)始出現(xiàn)的替代形式,而是出生時(shí)各種亞基包括ε-和γ-都已經(jīng)在NMJ上大量的表達(dá),然后在NMJ各種調(diào)控因子和神經(jīng)肌肉活動(dòng)的誘導(dǎo)下,胚胎型γ-nAChR逐漸消失,或者含有γ-nAChR的NMJ發(fā)生突觸消融,最后留下的是信號(hào)傳遞效率更高的含有成熟型ε-亞基的NMJ。本研究因研究時(shí)段的限制,未捕捉到nAChR各亞基表達(dá)高峰的出現(xiàn)時(shí)間,但推測(cè)ε-亞基表達(dá)高峰晚于γ-和δ-nAChR。

圖2 正常發(fā)育及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下3～8周齡大鼠腓腸肌ε-n AChRm RNA表達(dá)情況折線圖(n=8)Figure 2 Expressions ofε-nAChRm RNA in gastrocnemius of 3～8-week-old SD rats(compared between groups,n=8)

圖3 正常發(fā)育及運(yùn)動(dòng)干預(yù)下3～8周齡大鼠腓腸肌δ-nAChR m RNA表達(dá)情況折線圖(n=8)Figure 3 Expressions ofδ-nAChRm RNA in gastrocnemius of 3～8-week-old SD rats(compared between groups,n=8)

值得注意的是本研究發(fā)現(xiàn)γ-亞基表達(dá)減少的時(shí)間晚于其他兩種亞基(P<0.01),發(fā)生在4周齡以后,而ε-和δ-亞基的表達(dá)在3周齡就開(kāi)始大量減少,提示大鼠骨骼肌γ-ε亞基置換過(guò)程發(fā)生在出生后3～4周左右,即斷乳之后很短的一段時(shí)間。Saito等曾檢測(cè)大鼠咬肌nAChR的表達(dá),發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的成熟性轉(zhuǎn)化發(fā)生在出生后的3周內(nèi),與咬肌運(yùn)動(dòng)功能開(kāi)始的時(shí)間(大鼠斷乳進(jìn)食的時(shí)間為出生后3周左右)基本一致[13]。另一項(xiàng)研究小鼠舌肌和骨骼肌的結(jié)果顯示,出生時(shí)舌肌已完成γ-ε亞基轉(zhuǎn)換,但后肢骨骼肌尚未完成[18]。這可能是由不同部位肌肉的功能需要決定的,出生后即需要吸吮,而下肢運(yùn)動(dòng)功能在出生后10天左右才開(kāi)始發(fā)育,骨骼肌的運(yùn)動(dòng)功能發(fā)育顯然比負(fù)責(zé)吸吮的舌肌和負(fù)責(zé)咀嚼的咬肌復(fù)雜得多,其功能成熟的時(shí)間也應(yīng)與結(jié)構(gòu)完成成熟型轉(zhuǎn)換的時(shí)間相一致,因此,可以推斷出生后3～4周是大鼠骨骼肌NMJ功能成熟和運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)一步發(fā)育和完善的重要時(shí)期。本研究還發(fā)現(xiàn),γ-nAChR在5周齡以后又出現(xiàn)小量的表達(dá)增加,推測(cè)可能與青春期發(fā)育有關(guān),在此階段,各種NMJ誘導(dǎo)因子的表達(dá)增多,神經(jīng)肌肉活動(dòng)增強(qiáng),NMJ結(jié)構(gòu)進(jìn)一步發(fā)育完善,但這一過(guò)程并不會(huì)影響NMJ基本功能的穩(wěn)定。

從運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)nAChR三種亞基表達(dá)的影響來(lái)看,懸吊組γ-亞基表達(dá)減少的時(shí)間推遲,5周齡時(shí)仍顯著高于對(duì)照組(P<0.01),且在整個(gè)3～8周齡階段持續(xù)地表達(dá);運(yùn)動(dòng)組γ-亞基水平則顯著低于對(duì)照組(P<0.01),提示運(yùn)動(dòng)可能是骨骼肌NMJ發(fā)生γ-ε亞基置換、促進(jìn)胚胎型γ-亞基消退的誘導(dǎo)因素;這與一項(xiàng)對(duì)大鼠咬肌nAChR表達(dá)的研究結(jié)果相似,該研究發(fā)現(xiàn)咬肌運(yùn)動(dòng)減少(軟食喂養(yǎng))可以延緩γ-亞基消除的過(guò)程[2]。運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)可能通過(guò)增強(qiáng)神經(jīng)肌肉電活動(dòng)促進(jìn)了胚胎型γ-亞基的表達(dá)減少,從而加速γ-ε亞基置換的過(guò)程。在胚胎型nAChR缺乏的情況下,肌自發(fā)性肌電不能發(fā)生,提示γ-亞基與NMJ早期形成自發(fā)性電活動(dòng)有關(guān)[15]。本研究未發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)ε-亞基和δnAChR表達(dá)具有顯著影響。ε-亞基適應(yīng)于成年的肌肉運(yùn)動(dòng),Schwarz[14]等的研究也認(rèn)為,ε-亞基的表達(dá)似乎對(duì)神經(jīng)肌肉活動(dòng)的變化不敏感,只受固有的發(fā)育程序影響,這種神經(jīng)肌肉活動(dòng)不敏感性是使nAChR成熟以后保持相對(duì)穩(wěn)定的重要保障,有利于NMJ基本功能的維持和神經(jīng)肌肉信號(hào)的穩(wěn)定傳遞。肌肉失神經(jīng)支配后nAChR各亞基的表達(dá)一般都會(huì)增加,γ-亞基可能重新在成年個(gè)體表達(dá),ε-亞基則較為特殊,基本上不受失神經(jīng)支配的影響[6],雖然失神經(jīng)支配的過(guò)程比單純的運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)或減弱復(fù)雜,但其中也有神經(jīng)肌肉活動(dòng)減弱的過(guò)程,ε-亞基不受其影響也從另一個(gè)角度說(shuō)明其對(duì)運(yùn)動(dòng)干預(yù)不敏感,從而使NMJ成熟后能夠保持相對(duì)的穩(wěn)定。

5 結(jié)論

1.出生后骨骼肌NMJ中γ-、ε-、δ-nAChR亞基的表達(dá)在一定時(shí)期內(nèi)逐漸減少,γ-亞基的表達(dá)減少晚于其他兩種亞基,γ-ε亞基置換的時(shí)間是運(yùn)動(dòng)功能發(fā)育的敏感期;青春期nAChR亞基再次表達(dá)增加。

2.運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以在一定程度上影響骨骼肌NMJ的發(fā)育,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以促進(jìn)骨骼肌胚胎型γ-亞基的消退和γ-ε置換,運(yùn)動(dòng)不足則延緩這個(gè)過(guò)程;但運(yùn)動(dòng)對(duì)成熟型ε-和δ-亞基的表達(dá)無(wú)顯著影響,因此不會(huì)改變神經(jīng)肌肉信號(hào)傳遞的基本穩(wěn)定性。

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Effects of Activities on Expression of Nicotin ic Acetylcholine Receptor on Neuromuscular Junction of Skeletal M uscles in Growth Stage

AN Nan

Objective:To describe the development p rocess of skeletal neuromuscular junction (NMJ)in grow th stage as well as the effects of activities in this p rocess through the analysis of N acetylcho line recep to r(nAChR)subunits exp ressions.M ethods:3-week-o ld male SD rats have undergone activity increasing(treadmill training,group T)and activity decreasing(tail suspension,group H)intervention respectively.The exp ressions ofγ-,ε-,δ-nAchR m RNA w ere detected during 3～8 w eeks after birth.Results:1)γ-,ε-,δ-nAChR exp ressions in rat gastrocnemius decreased rapidly in 3～5 weeks after birth and only p resented trace amounts of exp ression at 5-w eek-old stage;2)the exp ression ofγ-nAChR was higher in group H at 5-w eek-old stage and low er in group T at 8-w eek-old stage compared w ith control group.There w ere no significant differences ofε-andδ-nAChR exp ressions between groups.Conclusion: The development of NMJ in postnatal stage has a typical sensitive period;exercise training can promote the recession of embryonicγ-nAChR,restriction on movements can significantly delay this p rocess instead.The NMJ has certain structural stability after getting mature.

NM J;grow th stage;development;nAChR subunit

G804.7

A

1000-677X(2011)11-0056-05

2011-09-19;

2011-10-25

國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)課題(2006-17)的部分研究成果。

安楠(1974-),女,河北秦皇島人,助理研究員,博士,研究方向?yàn)榘l(fā)展運(yùn)動(dòng)能力的理論與實(shí)踐,Tel:(010) 87182522,E-mail:cfaannan@yahoo.com.cn。

國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所,北京100061 China Institute of Sport Science,Beijing 100061,China.