張玉霞 周永列 徐 菲 邱蓮女

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的分子病因是由 9號(hào)染色體和 22號(hào)染色體易位所形成的費(fèi)城染色體(philadelphia chromosome,Ph+)。這一易位形成的BCR/Abl融合基因編碼一個(gè)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的 p210 BCR/Abl融合蛋白。這種蛋白還存在于約一半 Ph+的成人急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)中[1,2]。在髓系白血病中,p210 BCR/Abl可激活核因子 κB(nuclear factor kappa B,NF-κB),引起更多的 NF-κB進(jìn)核,并提高 NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[3],研究發(fā)現(xiàn),NF-κB異常的激活與白血病細(xì)胞的耐藥及抗凋亡基因的異常表達(dá)密切相關(guān),這些耐藥或抗凋亡因子是白血病復(fù)發(fā)或難治的重要原因[4～6]。因此選擇性地調(diào)控NF-κB的活性,阻斷 NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路,下調(diào)耐藥或凋亡抑制蛋白的異常表達(dá),有望成為以一種新的治療途徑。

四嗪二甲酰胺(ZGDHu-1)是一種新的四嗪類化合物(圖1),該化合物以乙醛和四合肼為原料,由胡惟孝教授等經(jīng)過(guò)十多年的努力設(shè)計(jì)合成,已獲國(guó)家專利,具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[7～9]。ZGDHu-1對(duì)耐藥細(xì)胞株 K562/Adr(K562-R)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。故本研究將采用體外實(shí)驗(yàn)法探討 ZGDHu-1對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株 K562(K 562-S)及其耐藥細(xì)胞株 K 562/Adr(K562-R)NF-κB的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。

圖1 ZGDHu-1的分子結(jié)構(gòu)

材料與方法

1.材料:ZGDHu-1由浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院制藥工程研究所合成,系白色片狀結(jié)晶。貯存液(1mg/ml)用二甲亞砜溶解,應(yīng)用液用含 10%小牛血清的RPMI 1640(Gibco公司產(chǎn)品)配制。二甲亞砜、噻唑藍(lán)(MTT)、蛋白酶 K為 Sigma公司產(chǎn)品;鼠抗人 Abl、 PARP-1、NF-κB/p65、兔抗人 β -actin及LaminA/C單克隆抗體,LaminA/C抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品,,膜聯(lián)蛋白 V(Annexin V)/異硫氰酸熒光素(FITC)試劑盒購(gòu)自美國(guó) Bender公司。DNA-Prepkit為美國(guó) Beckman-Coulter公司產(chǎn)品。

2.細(xì)胞培養(yǎng):K562細(xì)胞(K562-S)用含 10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。耐藥細(xì)胞株K 562/Adr(K562-R)為阿霉素誘導(dǎo) K 562細(xì)胞建立的耐藥型細(xì)胞株,由浙江大學(xué)腫瘤研究所提供。2～3天換液 1次,實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,以無(wú)藥物的無(wú)血清培養(yǎng)液靜置6h后,計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)在 90%以上時(shí)分組,加藥干預(yù),實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

3.MTT法測(cè)定 ZGDHu-1對(duì) K 562細(xì)胞生長(zhǎng)的影響:調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×104/m l,接種于 96孔培養(yǎng)板中,每孔 200μl。計(jì)算抑制率,求出 ZGDHu-1對(duì)K 562細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

4.Hoechst 33258熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡:收集 ZGDHu-1作用 48h后的細(xì)胞,涂片后用固定液(甲醇∶冰醋酸為3∶1)4℃固定 5m in,蒸餾水沖洗后加 5mg/L Hoechst 33258熒光染色 10m in,用蒸餾水沖洗后封片在熒光顯微鏡下觀察拍照。

5.G0/G1期細(xì)胞分析:收集 ZGDHu-1(0.25μg/m l)作用48h后的細(xì)胞懸液,用冷 PBS各洗滌 1次,加 50μl DNAPrepkit透膜液,放置 1min,然后加碘化丙錠染液(PI)200μl作用 15m in后,在 EPICS-XL型流式細(xì)胞儀(Beckman-Coluter產(chǎn)品)上分析,檢測(cè)分析至少 104個(gè)以上細(xì)胞。

6.細(xì)胞克隆形成分析:用 PBS配制 1%瓊脂糖凝膠,微波爐中融化置于 40℃水浴中,將平衡好的瓊脂糖膠和 2×1640培養(yǎng)基1∶1混合,快速倒入六孔板中,每孔 3ml,然后配制0.7%的瓊脂糖凝膠,將細(xì)胞濃度調(diào)為 1×103個(gè)/孔,分別加入相應(yīng)濃度 ZGDHu-1,與 0.7%的瓊脂糖凝膠1∶1混合,并快速加入到第一層凝膠上,將培養(yǎng)板置 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng) 7天后觀察結(jié)果。

7.Western blot印跡定量分析 NF-κB/p65、p 210 BCR/Abl及 PARP-1蛋白的表達(dá):藥物作用后的細(xì)胞經(jīng)離心收集,4℃預(yù)冷的 PBS洗滌細(xì)胞 2次,加入 100μl細(xì)胞裂解液冰浴30min,4℃14000g離心 15m in,收集上清液,采用 Pierce BCA Protein Assay Kit進(jìn)行蛋白定量。取 50μg蛋白按比例加入 5×SDS上樣緩沖液,沸水浴 5m in變性蛋白質(zhì),以 50μg/泳道上樣,采用 15%十二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠(SDS.PAGE)電泳 50min,移至硝酸纖維素膜上,含 5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉 60m in,分別加入 NF-κB/p 65、Ab l、PARP-1及 β-actin一抗(稀釋濃度為1∶1000～1∶500),4℃孵育過(guò)夜,用含 0.05%Tween20的 TBS洗滌后,加入1∶2000二抗室溫孵育 2h,ECL底物孵育,曝光洗片后數(shù)碼照相保存。圖像以GDS 8000圖像分析系統(tǒng)分析,以相應(yīng)蛋白條帶的平均光密度值與β-actin平均光密度值的比值表示各組蛋白表達(dá)水平。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有的數(shù)據(jù)均用 SPSS 12.0 for windows軟件包進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)用±+s表示,兩組間比較采用 t檢驗(yàn),以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.ZGDHu-1抑制 K562-S及 K562-R細(xì)胞增殖的效應(yīng):MTT比色法利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中的原理,用于檢測(cè)細(xì)胞活性。不同濃度的 ZGDHu-1對(duì) K562-S細(xì)胞均有增殖抑制作用,呈現(xiàn)劑量 -時(shí)間依賴關(guān)系。ZGDHu-1處理48h和 72h時(shí)的 IC50值分別為 0.25μg/ml、0.08μg/ml(圖2)。

圖2 不同濃度ZGDHu-1處理不同時(shí)間對(duì)K 562-S細(xì)胞增殖抑制作用

2 ZGDHu-1誘導(dǎo) K562-S及 K562-R細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果:ZGDHu-1作用 48h后,光鏡下可觀察到 K562-S及 K 562-R細(xì)胞染色質(zhì)固縮、胞核碎裂等典型的凋亡形態(tài),經(jīng)過(guò) Hoechst 33258熒光染色后,在熒光顯微鏡(×400)可見(jiàn)凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)濃染致密的顆粒熒光(圖3)。

圖3 K 562-S及 K 562-R細(xì)胞的凋亡

3.細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)的結(jié)果:為了判斷 ZGDHu-1是否對(duì)白血病干細(xì)胞具有增殖抑制作用,我們?cè)隗w外應(yīng)用了細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)。在 ZGDHu-1作用 7天后,K562-S及 K562-R細(xì)胞克隆形成被完全的抑制(圖4),這一結(jié)果暗示了 ZGDHu-1可能有誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞凋亡的作用。既然白血病干細(xì)胞通常存在于細(xì)胞周期的靜止期,我們進(jìn)一步用流式細(xì)胞儀分析了 G0/G1期細(xì)胞數(shù)的變化,K562-S及 K562-R細(xì)胞在 G0/G1期的細(xì)胞數(shù)分別 41.27%±0.81%、42.68%±0.78%,當(dāng) ZGDHu-1作用 48h后,分別減少為 21.65%±0.95%、29.32%±1.21%,這一結(jié)果提示 ZGDHu-1可能作用于靜止期的白血病干細(xì)胞[10]。

圖4 ZGDHu-1抑制 K 562-S及 K 562-R細(xì)胞克隆形成

4.ZGDHu-1作用后 K562-S及 K562-R細(xì)胞PARP-1、p210 BCR/Abl及 NF-κB/p65蛋白的表達(dá)的變化:Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,ZGDHu-1處理 K562-S及 K562-R細(xì)胞 48h后,均使聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]裂解,誘發(fā)細(xì)胞凋亡。與對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)的 p210 BCR/Abl、c-Ab l及 NF-κB/p65的表達(dá)均明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明 ZGDHu-1能夠下調(diào) K562-R細(xì)胞 p210 BCR/Abl及 c-Abl的表達(dá),抑制 K562-S及 K562-R細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi) NF-κB/p65的表達(dá) (圖5、表1)。

討 論

圖5 ZGDHu-1作用后 K 562-S及 K 562-R細(xì)胞PARP-1、p 210Bcr/Abl及 NF-κB/p65蛋白的表達(dá)

表1 ZGDHu-1對(duì) K 562-S及 K 562-R細(xì)胞 p210Bcr/Abl及 NF-κB/p 65蛋白表達(dá)的影響(比值,±+s)

表1 ZGDHu-1對(duì) K 562-S及 K 562-R細(xì)胞 p210Bcr/Abl及 NF-κB/p 65蛋白表達(dá)的影響(比值,±+s)

*P＜0.05,與對(duì)照組相比具有顯著性差異

組別 K 562-S細(xì)胞NF-κB/p65/β-actin K 562-R細(xì)胞p 210BCR/Abl/β-actin c-Abl/β -actin NF-κB/p65/β -actin對(duì)照組 1.65±0.150 1.12±0.211 0.34±0.092 1.92±0.121 0.25μg/m l組 0.97±0.110* 0.99±0.101* 0.23±0.031* 1.21±0.130*0.5μg/m l組 0.56±0.083* 0.56±0.110* 0.11±0.023* 0.43±0.091*

尋找既能抑制腫瘤生長(zhǎng),又具高效低毒的抗癌藥物,是目前抗腫瘤藥物研究的主要方向。研究結(jié)果表明 ZGDHu-1能有效地抑制 K562-S及 K562-R細(xì)胞的增殖,呈現(xiàn)劑量 -時(shí)間依賴效應(yīng),并能使聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]裂解,PARP是存在于真核細(xì)胞中催化聚ADP核糖化的細(xì)胞核酶,而在 PARP家族成員中以PARP-1結(jié)構(gòu)最典型,其相對(duì)分子質(zhì)量為 116kDa。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中,半胱 -天冬蛋白酶casepase-7和 casepase-3可以通過(guò)識(shí)別 PARP-1核定位信號(hào)(NLS)的 DEVD模序,促使 DNA結(jié)合域與催化域分離導(dǎo)致 PARP-1分裂成 p89和 p24兩個(gè)片段,后者可不可逆結(jié)合于 DNA缺口,抑制 PARP-1與 DNA缺口結(jié)合能力,導(dǎo)致 PARP-1損傷修復(fù)作用喪失,誘發(fā)凋亡[11]。另外,PARP-1在凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)介導(dǎo)的半胱 -天冬蛋白酶非依賴型的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[12]?？梢?jiàn) PARP-1的裂解在凋亡機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),ZGDHu-1作用K562-S及 K562-R細(xì)胞 48h后 PARP-1發(fā)生裂解,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

BCR/Abl已被證明是造成白血病的癌基因,BCR/Abl激酶可以將磷酸鹽從 APT上轉(zhuǎn)到各種底物的酪氨酸殘基上面引發(fā)慢性粒細(xì)胞性白血病(CML),可見(jiàn) BCR/Abl激酶在 CML發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用,因此,Abl蛋白酪氨酸激酶的抑制劑應(yīng)該能有效地選擇性地治療 CML和其他 BCR/Abl陽(yáng)性的白血病[13～15]。然而,目前大部分使用酪胺酸激酶抑制劑治療的病人,由于其 BCR/Abl激酶的突變,對(duì)此藥物都產(chǎn)生了耐藥。本研究證實(shí),ZGDHu-1在體外能抑制耐藥型 K562細(xì)胞的增殖的同時(shí),有效抑制 BCR/Abl酪氨酸激酶的活性,下調(diào)包括p210BCR/Abl及 c-Abl的表達(dá)。這為其靶向性治療打下了重要的基礎(chǔ)。

耐藥與復(fù)發(fā)是白血病治療失敗兩大主要原因,但其病因與確切分子機(jī)制迄今不詳。近年來(lái),已有越來(lái)越多的研究表明,白血病患者體內(nèi)除了含有大量幼稚白血病細(xì)胞外,還存在著一群比例極少的白血病干細(xì)胞(LSCs)。這些腫瘤性干細(xì)胞對(duì)目前常用的化療藥物不敏感,被認(rèn)為是白血病耐藥和復(fù)發(fā)的主要根源,只有清除 LSCs才有可能根治白血病。本實(shí)驗(yàn)顯示,ZGDHu-1在對(duì) k562-S細(xì)胞及 k562-R細(xì)胞的克隆形成均有一定的抑制作用,表明其對(duì) LSCs具有一定的影響,其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路是與白血病發(fā)生有關(guān)的重要途徑。NF-κB家族主要的二聚體是 RelA(p65)/NF-κB1(p50)異源二聚體,但只有 p65的末端含有反式激活結(jié)構(gòu)域,具有激活基因轉(zhuǎn)錄的作用,是 NF-κB活性形式的主要成分,因此實(shí)驗(yàn)中常常檢測(cè) NF-κBp65代表NF-κB的活性。研究表明,NF-κB持續(xù)激活與白血病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,許多因素可以誘導(dǎo) NF-κB激活,啟動(dòng)基因的異常轉(zhuǎn)錄活動(dòng),NF-κB是一種細(xì)胞凋亡相關(guān)因子,可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子(IL-2,3,6,12,GM-CSF)產(chǎn)生,從而抑制細(xì)胞凋亡,其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制在腫瘤細(xì)胞多重耐藥機(jī)制的形成中起一定作用。NF-κB的不適當(dāng)激活與細(xì)胞耐藥有密切關(guān)系,對(duì) NF-κB進(jìn)行調(diào)控已成為目前抗腫瘤治療的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ZGDHu-1本身對(duì) K562-S及 K562-R細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用,同時(shí) ZGDHu-1可以抑制 K562-S及K562-R細(xì)胞的 NF-κB的活性。綜上所述,ZGDHu-1有望成為一種治療慢性白血病的新藥,尤其對(duì)于耐藥型白血病的治療具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

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