曾珠 吳一龍

肺癌是美國(guó)病死率最高的惡性腫瘤[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%-85%，其傳統(tǒng)治療方法包括化療、放療、手術(shù)等。隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，分子靶向治療已經(jīng)成為了研發(fā)熱點(diǎn)，并初步取得了療效。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、棘皮動(dòng)物微管樣蛋白4-間變淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule associated protein like4-anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK）等靶點(diǎn)的分子抑制劑在臨床上的成功讓學(xué)者們將更多的精力投入到分子靶向的研究中。2011年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（American Society of Clinical Oncology, ASCO）大會(huì)提示腫瘤診療已經(jīng)進(jìn)入分子靶向治療的時(shí)代。既往研究[2-4]認(rèn)為NSCLC中EML4-ALK融合基因與EGFR及KRAS（Kirsten Ras）突變是相互排斥的。近期陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有EML4-ALK融合基因和EGFR突變共存的案例。在強(qiáng)調(diào)個(gè)體化治療的時(shí)代，這部分患者的臨床表現(xiàn)特點(diǎn)和治療方法值得研究，本文就這些問(wèn)題進(jìn)行綜述。

1 EML4-ALK融合基因的分子結(jié)構(gòu)和在NSCLC中的發(fā)生率

間變淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）是一個(gè)由細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)組成的1,620個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，屬于胰島素受體家族[5]。

棘皮動(dòng)物微管相關(guān)樣蛋白4（echinoderm microtubule-associated protein-like 4, EML4）屬于棘皮動(dòng)物微管相關(guān)樣蛋白家族，由N末端堿基區(qū)（N-terminal basic region）、疏水的棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白（hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein, HELP）區(qū)以及WD重復(fù)區(qū)（WD-repeat region）3 部分構(gòu)成。WD重復(fù)區(qū)是一段通常以色氨酸-天冬氨酸結(jié)尾的氨基酸的序列，包含了4個(gè)-16個(gè)重復(fù)的單元，其所有的單元一起形成一個(gè)beta螺旋結(jié)構(gòu)。WD重復(fù)區(qū)作為一個(gè)大家族廣泛存在于真核生物中，負(fù)責(zé)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期控制、細(xì)胞凋亡調(diào)控等。研究[2]證明在EML4-ALK融合基因中，以上3個(gè)部分都與腫瘤的形成有關(guān)，其中N末端堿基區(qū)的作用最為重要。

EML4-ALK融合基因是由日本學(xué)者Soda等在1名62歲有吸煙史的男性腺癌患者的腫瘤組織中首次發(fā)現(xiàn)的?；虻闹嘏虐l(fā)生在2號(hào)染色體短臂上的2區(qū)1帶和2區(qū)3帶，由ALK基因的3′端與EML4基因的5′倒位融合形成。EML4基因斷裂后形成不同長(zhǎng)度的外顯子拼接片段，插入位置相對(duì)保守的ALK基因的19號(hào)、20號(hào)外顯子之間，從而形成有11個(gè)變體的EML4-ALK融合蛋白[2,3,6-11]。融合基因大多都有致瘤性[12]，其中變體1最常見(jiàn)，變體3a/3b次之[13]。以最常見(jiàn)的變體1為例，EML4在WD重復(fù)區(qū)處斷裂，形成一個(gè)由N末端堿基區(qū)、HELP區(qū)、部分WD重復(fù)區(qū)組成的片段與ALK的胞內(nèi)區(qū)融合[2]。融合基因中EML4的啟動(dòng)子位于ALK胞內(nèi)酪氨酸激酶的上游，從而導(dǎo)致融合基因活化，表達(dá)EML4-ALK融合蛋白。通過(guò)EML4的胞外結(jié)構(gòu)形成的二聚體使ALK在缺乏配體的情況下受體持續(xù)自磷酸化，進(jìn)而持續(xù)激活下游細(xì)胞信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[14]。

文獻(xiàn)[15]報(bào)道不加選擇的NSCLC患者EML4-ALK融合基因總發(fā)生率為3.4%（范圍0.4%-11.6%）。東方人群NSCLC患者的總發(fā)生率為4.1%，歐美人群為2.5%。Shaw等[9]在女性、亞裔、不吸煙或者是輕度吸煙（每年吸煙≤10包或戒煙≥1年者）這4個(gè)條件至少滿(mǎn)足2個(gè)條件的141名肺腺癌患者的腫瘤組織中用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescent in situ hybridization, FISH技術(shù)）檢測(cè)了EML4-ALK融合基因的發(fā)生率，結(jié)果顯示其發(fā)生率高達(dá)13%；在EGFR和KRAS均為野生型的不吸煙/輕度吸煙者則為33%。Zhang等[4]用RACE-coupled PCR sequencing法在中國(guó)NSCLC患者中進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明中國(guó)的非選擇性NSCLC患者中該融合基因的發(fā)生率為11.6%，EGFR和KRAS均為野生型的不吸煙/輕度吸煙者高達(dá)42.8%。

2 EGFR突變基因的分子結(jié)構(gòu)及發(fā)生率

EGFR具有受體酪氨酸激酶活性，屬于I型生長(zhǎng)因子受體家族，由1個(gè)胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和1個(gè)胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成。EGFR與配體結(jié)合后形成同源或異源二聚體，引起構(gòu)象變化，激活下游的多個(gè)信號(hào)通路，在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移的多個(gè)環(huán)節(jié)中起調(diào)節(jié)作用。

EGFR基因位于7號(hào)染色體短臂的12-14區(qū)，由28個(gè)外顯子組成，突變多位于19-21外顯子（酪氨酸激酶功能區(qū)），其突變主要有3種類(lèi)型：①19外顯子堿基缺失，改變了受體ATP結(jié)合囊（ATP-binding pocket, ABP）角度，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）的敏感性[16,17]，Shigematsu等[18]發(fā)現(xiàn)19外顯子突變的發(fā)生率最高，占EGFR突變總數(shù)的50%以上；②20外顯子點(diǎn)突變或堿基插入突變，20外顯子的點(diǎn)突變主要是第790位密碼子出現(xiàn)C-T轉(zhuǎn)換，從而引起該處的蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼幔═790M），這一突變多見(jiàn)于藥物治療后的復(fù)發(fā)患者，突變后腫瘤細(xì)胞對(duì)TKIs產(chǎn)生抵抗[19]。插入突變出現(xiàn)在第770-775位密碼子，插入一個(gè)長(zhǎng)約3個(gè)-9個(gè)堿基的片段，約5%的NSCLC患者出現(xiàn)插入突變。體外實(shí)驗(yàn)表明，與19及21外顯子突變相比，20外顯子插入突變的患者對(duì)EGFR-TKIs不敏感并且大多數(shù)出現(xiàn)疾病進(jìn)展[20]；③21外顯子點(diǎn)突變，主要是851位密碼子出現(xiàn)T-G轉(zhuǎn)換，亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔↙858R），突變提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)TKIs的敏感性[17]。

在非選擇性NSCLC患者中，EGFR在美國(guó)的NSCLC腺癌患者中突變率約為15%[21]；在亞裔人群為30%-50%，且大部分是腺癌和支氣管肺泡癌[22]。

3 EGFR-TKIs、ALK-TKIs靶向治療的療效

ALK的口服抑制劑PF-02341066（Crizotinib）的I期臨床試驗(yàn)（NCT00585195或A8081001）開(kāi)始于2006年。2009年ASCO年會(huì)上報(bào)道，PF-02341066的有效率達(dá)53%（10/19），疾病控制率達(dá)到79%（12/19）。鑒于良好的安全性和較高有效率，美國(guó)食品及藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)此藥直接進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)。目前該藥的全球III期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。2011年ASCO對(duì)Crizotinib的I期臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了更新，入組NSCLC患者已達(dá)119例，中位無(wú)進(jìn)展生存期達(dá)到10個(gè)月（95%CI： 8.2-14.7），客觀有效率為61%（95%CI：52%-70%）。中位有效應(yīng)答時(shí)間為48 w，中位生存時(shí)間達(dá)1年的概率為81%[23]。

與EGFR-TKIs及其它酪氨酸激酶抑制劑一樣，即使在治療初期Crizotinib能取得明顯的療效，腫瘤最終也會(huì)對(duì)Crizotinib耐藥。日本的研究者Choi等[24]在1例Crizotinib治療后復(fù)發(fā)患者的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了兩處新突變，即4374G→A和4493C→A。兩個(gè)堿基突變分別導(dǎo)致了氨基酸C1156Y和L1196M的改變，從而影響ALK與Crizotinib或ATP的結(jié)合。Choi等推測(cè)，這兩個(gè)點(diǎn)突變能分別獨(dú)立導(dǎo)致耐藥發(fā)生，其中管家基因L1196M突變導(dǎo)致的耐藥性比C1156Y更強(qiáng)。

針對(duì)管家基因L1196M耐藥后的治療，Katayama等[25]提出可以用比Crizotinib活性更強(qiáng)的ALK抑制劑如TAE684及AP26113，或是HSP90抑制劑進(jìn)行治療。Sakamoto等[26]也用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ALK抑制劑CH5424802能高選擇性抑制L1196M突變的細(xì)胞生長(zhǎng)。

EGFR抑制劑吉非替尼和厄洛替尼目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于晚期NSCLC臨床各線的治療。IPASS研究[27]比較了一線使用EGFR-TKIs與一線使用化療藥物的療效，發(fā)現(xiàn)EGFR突變患者是吉非替尼治療的最大獲益人群。鑒于IPASS及其他三項(xiàng)基于EGFR突變的臨床試驗(yàn)研究結(jié)果，ASCO于今年4月發(fā)布了PCO（provisional clinical opinion），建議對(duì)晚期初治的NSCLC患者進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)以決定患者是進(jìn)行EGFR-TKIs治療還是進(jìn)行化療[21]。

4 EML4-ALK與EGFR突變共存患者的臨床特征

EML4-ALK融合基因型患者與EGFR基因突變型患者有相似的臨床特征[9,28]，如多見(jiàn)于不/輕度吸煙的腺癌患者，但EML4-ALK融合基因型患者多為年輕的男性患者，且不能從EGFR-TKIs治療中獲益[9]。

既往研究[2,6,7,9,13]認(rèn)為EML4-ALK融合型基因與EGFR基因突變是互為獨(dú)立的分子事件，EML4-ALK融合型基因可能是繼KRAS之后的EGFR對(duì)TKI耐藥的另外一個(gè)原因。目前已報(bào)道了8例[4,6,29-31]EML4-ALK融合型基因與EGFR基因突變共存型患者（表1，其中1例無(wú)臨床信息未在表中列出），其所表現(xiàn)的臨床特點(diǎn)與既往的研究有所不同。

這7例大部分為女性（4/7）、亞裔（6/7）、無(wú)吸煙史（6/7）的晚期患者，中位年齡56歲，病理類(lèi)型幾乎都是腺癌（6/7），EGFR突變既可以是19外顯子缺失（4/7）也可以是21外顯子點(diǎn)突變（3/7），但EML4-ALK主要是變體1的融合。特別指出的是，在一線使用EGFRTKIs的5例患者中，療效均達(dá)到部分緩解（第7例患者二線治療行右上肺切除+淋巴結(jié)清掃+肋骨切除術(shù)，三線治療使用2個(gè)月厄洛替尼后死于疾病進(jìn)展），這與傳統(tǒng)認(rèn)為的EML4-ALK融合基因的患者對(duì)EGFR-TKIs耐藥的觀點(diǎn)[9]顯然不一致。

5 展望

EML4-ALK融合基因是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，極有可能像EGFR突變那樣成為NSCLC的一個(gè)亞型。PF-02341066（Crizotinib）的III期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，Crizotinib能否像EGFR-TKIs一樣成為NSCLC治療上的一個(gè)里程碑值得期待。EGFR-TKIs目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床的治療，在治療晚期EGFR突變的NSCLC患者中療效明顯。但對(duì)于EML4-ALK融合基因與EGFR基因突變共存型患者，目前的研究和報(bào)道還很少，仍有許多問(wèn)題值得思考和研究，包括共存型患者其EML4-ALK與EGFR下游的分子生物學(xué)行為、案例報(bào)道中患者對(duì)EGFR TKIs的反應(yīng)不一致的原因是否為EML4-ALK不同變體對(duì)EGFR TKIs的敏感性不同、僅第7例患者對(duì)EGFR-TKIs不敏感是否是化療改變了腫瘤對(duì)TKIs的敏感性所致、對(duì)于共存型患者該如何應(yīng)用TKIs、多靶點(diǎn)抑制劑會(huì)不會(huì)是共存型患者的更好選擇、耐藥的機(jī)制仍不清楚以及耐藥后患者應(yīng)如何治療等。期待更加深入的實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究來(lái)解決上述問(wèn)題，使患者以最小的花費(fèi)取得最佳療效，真正在基因水平上實(shí)現(xiàn)肺癌的個(gè)性化治療。

表 1 7例EML4-ALK 融合基因和EGFR 突變共存患者的臨床特征Tab 1 The clinical features of 8 patients with EML4-ALK fusion gene and EGFR mutation