王建忠 王春生 王坤正＊＊ 周金秋

(1內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，呼和浩特010030;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨外科，西安710004;3解放軍第253醫(yī)院呼吸內(nèi)科，呼和浩特010051)

基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinase，MMPs)及其特異性抑制因子基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)是參與降解包括骨在內(nèi)的全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶家族。已證實(shí)MMPs/TIMPs系統(tǒng)在幾乎機(jī)體各種組織的發(fā)育和修復(fù)[1，2]、腫瘤發(fā)生發(fā)展[3-6]、炎癥反應(yīng)[7]等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，與激素性骨壞死的發(fā)生也存在一定關(guān)系[8]。

近年有研究表明，治療骨質(zhì)疏松常用藥，第三代二磷酸鹽，阿侖膦酸鈉可以抑制MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)，降低MMPs/TIMPs比率，抑制骨基質(zhì)降解[9-11]。那么，是否阿侖膦酸鈉可以通過(guò)對(duì)MMP/TIMP系統(tǒng)的作用來(lái)拮抗激素性骨壞死，值得我們進(jìn)一步探討。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素SD大鼠，預(yù)防性給予阿侖膦酸鈉干預(yù)，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)，觀察阿侖膦酸鈉對(duì)大鼠股骨頭骨組織 MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA表達(dá)的影響，評(píng)估阿侖膦酸鈉是否可以通過(guò)對(duì)MMPs/TIMPs系統(tǒng)的作用來(lái)預(yù)防激素性骨壞死，為臨床應(yīng)用阿侖膦酸鈉預(yù)防激素性骨壞死提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3個(gè)月齡的健康SD大鼠30只，雌雄各半，體重250～300 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

ABI 7000型Real time-PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品;醋酸潑尼松龍由湖北制藥有限公司提供;骨組織RNA提取試劑Trizol為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)試劑盒為立陶宛Fermentas公司產(chǎn)品;引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.3 動(dòng)物造模、分組及藥物處理

30只大鼠隨機(jī)分為激素組、阿侖膦酸鈉組和對(duì)照組，每組10只，激素組和阿侖膦酸鈉組給予12.5 mg/kg醋酸強(qiáng)的松龍肌注，阿侖膦酸鈉組同時(shí)給予阿侖膦酸鈉5 mg/kg灌胃，每周1次;對(duì)照組按同樣的方法給予相同容積的生理鹽水，每周2次。

1.4 組織學(xué)檢查

用藥4周后處死動(dòng)物，取左側(cè)股骨頭，10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液固定，乙二胺四乙酸 (EDTA)脫鈣，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切成5 μm厚切片，HE染色后，顯微鏡下觀察，鑒定股骨頭壞死情況。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2006年我國(guó)制定的股骨頭壞死診斷和治療的建議[12]:骨活檢顯示骨小梁的骨細(xì)胞空陷窩多于50%，且累及鄰近多處骨小梁，有骨髓壞死。

1.5 RT-PCR檢測(cè)

采用Real time PCR儀檢測(cè)大鼠骨組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達(dá)水平。

1.5.1 骨標(biāo)本總RNA的提取 處死大鼠，快速取出右側(cè)股骨大轉(zhuǎn)子，剔除軟骨后置于盛有1ml Trizol的研磨器中仔細(xì)研碎并孵育5 min，氯仿沉淀，離心后取上清。用等體積異丙醇沉淀RNA后離心去上清，750 ml/L乙醇洗滌，風(fēng)干后用焦碳酸二乙酯處理水溶解，經(jīng)過(guò)電泳證實(shí)提取總RNA完整性，RNA總量能夠滿足下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 cDNA第1鏈的合成 取總RNA 500 ng，加隨機(jī)引物1μl，焦碳酸二乙酯處理水補(bǔ)至12μl，依照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈，保存于-70℃冰箱。

1.5.3 RTQ-PCR檢測(cè) 根據(jù)目的基因在GenBank中的己知序列，采用premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。選25 μl反應(yīng)體系，參照Real time-PCR儀說(shuō)明書(shū)，三步法進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件:95℃35 s，1個(gè)循環(huán)預(yù)變性;95℃ 5 s變性，58℃ 20 s退火，72℃ 35 s延伸，45個(gè)循環(huán)。通過(guò) ABI prism 7000SDS軟件對(duì)各組目的基因作相對(duì)定量。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料均數(shù)用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨頭骨組織HE染色表現(xiàn)

4周時(shí)，激素組與阿侖膦酸鈉組各有1只動(dòng)物死亡。死亡原因主要是飲食量逐漸減少，體重下降，全身逐漸衰竭而死。對(duì)照組股骨頭骨組織切片HE染色可見(jiàn)骨小梁由板層骨構(gòu)成，絕大多數(shù)小梁骨陷窩內(nèi)可見(jiàn)骨細(xì)胞，小梁間為血管和骨髓。激素組表現(xiàn)為骨小梁稀疏和大量不連續(xù)的骨碎片及骨髓壞死，碎片骨陷窩內(nèi)骨細(xì)胞大部分消失，周圍有大量炎性肉芽組織，阿侖膦酸鈉組介于二者之間，輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，骨小梁略纖細(xì)，多數(shù)小梁骨陷窩內(nèi)可見(jiàn)骨細(xì)胞，小梁間為血管和骨髓 (圖1)。

2.2 MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA 表達(dá)結(jié)果

三組目的基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)片段大小，在相應(yīng)位置出現(xiàn)目的條帶(圖2)。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)出各組目的基因的表達(dá)水平 (表2)，結(jié)果顯示:激素組與對(duì)照組比較，MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)增高，TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);阿侖膦酸鈉組與對(duì)照組比較，除MMP-2有顯著性差異外，其余無(wú)顯著性差異;阿侖膦酸鈉組與激素組比較，MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)降低，TIMP-1、TIMP-2 mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

MMPs及其特異性抑制因子TIMPs是參與降解包括骨在內(nèi)的全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶家族。已證實(shí)MMPs/TIMPs系統(tǒng)在幾乎機(jī)體各種組織的發(fā)育和修復(fù)[1，2]、腫瘤發(fā)生發(fā)展[3-6]、炎癥反應(yīng)[7]等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，與激素性骨壞死的發(fā)生也存在一定關(guān)系[8]。

圖1 三組大鼠股骨頭骨組織HE染色 (×20)

圖 2 MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA表達(dá)

表2 各組大鼠股骨頭骨組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 mRNA表達(dá)

關(guān)于阿侖膦酸鈉對(duì)MMP/TIMP系統(tǒng)的影響，有研究表明，二磷酸鹽類藥物對(duì)MMP-1、2、3、7、8、9、12、14、等多種MMP有抑制作用。Ichinose等[13]報(bào)道雙磷酸鹽減少培養(yǎng)的成骨細(xì)胞MMP-2的產(chǎn)生。研究表明單獨(dú)應(yīng)用雙磷酸鹽并不影響人成骨細(xì)胞產(chǎn)生MMP-2，但有生理濃度血漿存在的條件下，則可抑制成骨細(xì)胞中的MMP-2的分泌且同時(shí)誘導(dǎo)其降解，提示雙磷酸鹽于體內(nèi)具有抑制MMPs分泌的作用。Cheng等[14]等通過(guò)對(duì)阿侖膦酸鈉干預(yù)兩種骨肉瘤細(xì)胞株的研究證實(shí)，阿侖膦酸鈉呈劑量依賴性抑制細(xì)胞MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)。Teronen等[15]證實(shí)二膦酸鹽在非細(xì)胞毒性濃度時(shí)抑制MMP-1，-2，-8，-9。Kim 等[16]研究證實(shí)，出生后7～10 d內(nèi)的SD大鼠，給予阿侖膦酸鈉可以降低髁狀突軟骨MMP-9的表達(dá)。Lai等[17]在探討阿侖膦酸鈉對(duì)軟骨瘤細(xì)胞遷移和入侵的研究中發(fā)現(xiàn)，阿侖膦酸鈉呈劑量和時(shí)間依賴性抑制MMP-2活性和mRNA水平和抑制軟骨瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。Maugeri等[21]通過(guò)調(diào)查60歲以上的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者。給予3種二膦酸鹽治療，并檢測(cè)外周血循環(huán)中MMP-9水平和腰椎骨密度的水平，經(jīng)過(guò)12個(gè)月的治療。結(jié)果表明，血循環(huán)中MMP-9水平顯著減少和骨密度增加。

皮質(zhì)激素對(duì)MMPs/TIMPs系統(tǒng)的作用機(jī)理，研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素通過(guò)與AP-1位點(diǎn)結(jié)合抑制膠原酶基因的表達(dá)，證實(shí)糖皮質(zhì)激素能在轉(zhuǎn)錄水平阻斷MMP基因表達(dá)[19]。關(guān)于阿侖膦酸鈉對(duì) MMPs/TIMPs系統(tǒng)的作用機(jī)理，研究表明，雙膦酸化合物對(duì)MMPs的抑制作用主要是通過(guò)雙膦酸基團(tuán)與酶活性位點(diǎn)鋅離子的絡(luò)合作用，占據(jù)活性位點(diǎn)而產(chǎn)生抑制效應(yīng)，而且，雙膦酸的R2基團(tuán)與MMPs S1空腔的結(jié)合也對(duì)其抑制效應(yīng)有一定影響[20]。

在前期研究中，我們已經(jīng)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，糖皮質(zhì)激素醋酸潑尼松龍可以促進(jìn)大鼠MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)，抑制TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表達(dá)，認(rèn)為長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的骨壞死可能與其對(duì)MMPs/TIMPs系統(tǒng)的影響有關(guān)[21-22]。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)對(duì)長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的大鼠，預(yù)防性給予阿侖膦酸鈉干預(yù)，觀察到阿侖膦酸鈉可以拮抗糖皮質(zhì)激素的這種作用。提示阿侖膦酸鈉可以通過(guò)對(duì)MMPs/TIMPs系統(tǒng)的“正性”干預(yù)作用，來(lái)拮抗糖皮質(zhì)激素的“負(fù)性”作用，有效預(yù)防激素性股骨頭壞死，為臨床應(yīng)用阿侖膦酸鈉預(yù)防激素性骨壞死提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在下一步研究中，我們將通過(guò)臨床試驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)阿侖膦酸鈉能通過(guò)MMPs/TIMPs系統(tǒng)有效防止激素性骨壞死，為早期防治激素性骨壞死提供一條可能途徑。

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