王凌挺 徐宏光 王 弘 劉 平 陳學(xué)武 楊曉明 張 玙 李逸峰

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院脊柱外科，蕪湖市241001)

椎間盤退變是導(dǎo)致腰腿痛疾病的主要原因，然而目前椎間盤退變機(jī)制尚不明確。終板軟骨不僅能維持椎間盤結(jié)構(gòu)完整性，而且軟骨終板途徑是椎間盤的重要營養(yǎng)通路，對椎間盤營養(yǎng)途徑及形態(tài)維持都具有十分重要的作用，終板軟骨退變可導(dǎo)致椎間盤退變[1，2]。因此，對終板軟骨退變研究具有重要意義。

Asporin是2001年在關(guān)節(jié)軟骨和半月板中被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，該蛋白質(zhì)在骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨中大量表達(dá)且與骨關(guān)節(jié)的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[3]。Asporin基因位于染色體9q22.31，長約26 kb，包含8個外顯子，編碼含380個氨基酸殘基的蛋白，其中包含一條由14個氨基酸殘基組成的信號肽，1條由18個氨基酸殘基組成的前肽，4個N末端半胱氨酸殘基 (C-X3-C-X-X6-C)，10個LRR及2個C末端半胱氨酸殘基[4]。

骨關(guān)節(jié)炎病與椎間盤退變均為骨關(guān)節(jié)退變性疾病，Asporin基因不僅是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的易感基因，而且是椎間盤退變發(fā)生的易感基因。目前研究表明退變椎間盤纖維環(huán)內(nèi)Asporin蛋白表達(dá)明顯增高，且與椎間盤退變程度呈正比。終板軟骨內(nèi)是否有Asporin蛋白表達(dá)及對椎間盤退變的有何影響目前研究甚少。本文旨在研究大鼠終板軟骨細(xì)胞體外自然退變過程中Asporin基因的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動物:10只清潔級 SD大鼠 (4周齡)，雌雄不限，體重 (100±20)g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，合格證號:SCXK(滬)2003-0002。

試劑和儀器:胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶 (Sigma-Aldrich，美國);DMEM/F12(Hyclone，美國);胎牛血清 (Gibico，美國);細(xì)胞計數(shù)儀和TRIzol(Invitrogen， 美 國 ); Nano-Drop 2000(Thermo＆Scientific，美國);PCR反應(yīng)體系和反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Fermentas，美國);PCR儀 (Eppendorf，德國);RealTime PCR kit(TOYOBO，中國);Real-Time PCR儀 (Roche LightCycler 480，德國)。Odyssey紅外成像系統(tǒng) (Li-Cor;英國)，ASPN抗體 (ab58741，abcam，美國)。

1.2 方法

大鼠原代終板軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng):取10只SD大鼠，采取頸斷法處死，75%乙醇消毒10 min，在超凈臺中取出整個腰椎，削取所有大鼠的終板軟骨。放入PBS中洗2～3次，用眼科剪剪碎至約1 mm3，吸除PBS，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶10 ml，放置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化4～5 h，將懸濁液倒入120目不銹鋼濾篩網(wǎng)過濾，過濾的液體以1000 r/min離心10 min，輕輕吸除消化液，加入PBS漂洗1次，放入8 ml含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，均勻種植，將10 cm培養(yǎng)皿中放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液1次。按徐宏光建立的終板軟骨細(xì)胞體外自然退變模型，取P1代與P5代終板軟骨細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。細(xì)胞融合為單層時進(jìn)行傳代，從終板軟骨分離下來的第一次培養(yǎng)終板軟骨細(xì)胞定義為P0代[5]。

實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng) (Real-Time PCR):檢測Asporin和GAPDH表達(dá)變化。將反轉(zhuǎn)的cDNA稀釋5倍，進(jìn)行Real-Time PCR，引物序列見表1。擴(kuò)增體系 10.0 μl:SYBR Premix ExTaqTM(2 ×)5.0 μl，PCR 上游引物 (10 μmol/L)0.2 μl，PCR 下游引物 (10 μmol/L)0.2 μl，稀釋 cDNA 模板2.0 μl，滅菌超純水2.6 μl。樣品混合后于 Real-Time PCR儀上反應(yīng)。Real-Time PCR引物見表1。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s、60℃退火延伸25 s，擴(kuò)增50個循環(huán)。溶解曲線分析:95℃ 0 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s;溶解曲線為單一峰說明是特異性擴(kuò)增。滅菌超純水作為陰性對照，每個模板做3個復(fù)孔，GAPDH作內(nèi)參，結(jié)果使用相對定量 2-△△Ct方法分析[6]。

Western Blot:細(xì)胞蛋白提取定量變性，20 μg樣品加入到12%的SDS-PAGE中電泳，轉(zhuǎn)膜，加入一抗4度過夜，二抗1小時后到odyssey機(jī)器上成像。

表1 RealTime PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Excel 2007軟件計算各基因相對表達(dá)量，數(shù)據(jù)以±s，表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，結(jié)果由SPSS13.0輸出，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 終板軟骨細(xì)胞形態(tài)及表型鑒定

終板軟骨細(xì)胞從P1代傳至P5代，細(xì)胞增殖速度變慢，且有梭形趨勢。HE染色見P1代終板軟骨細(xì)胞細(xì)胞以多角形為主，核為圓形或橢圓形，偶見雙核，折、旋光性強(qiáng)，胞質(zhì)內(nèi)可見空泡;P5代終板軟骨細(xì)胞核仁不清，變形明顯，以梭形為主，折、旋光性弱，細(xì)胞間隙大，胞質(zhì)內(nèi)可見空泡、脂滴，呈成纖維化趨勢。甲苯胺藍(lán)染色可見P1和P5終板軟骨細(xì)胞胞質(zhì)及周圍有紫紅色或紅色異染 (圖1)。

2.2 體外自然退變過程中軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原及蛋白多糖的表達(dá)

Real-time RT-PCR顯示P5代終板軟骨細(xì)胞內(nèi)Ⅱ型膠原和蛋白多糖較P1代表達(dá)均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (0.1±0.0 vs 1.0±0.16，0.3±0.02 vs 1.0±0.04，P均＜0.05)。

2.3 體外自然退變過程中終板軟骨細(xì)胞中Asporin蛋白的表達(dá)

Western blot顯示P5代終板軟骨細(xì)胞內(nèi)Asporin蛋白表達(dá)較P1代明顯上調(diào) (圖2)。

3 討論

終板軟骨細(xì)胞主要表達(dá)具有軟骨表型特征的蛋白多糖和Ⅱ型膠原，在椎間盤退變過程中起著重要作用，終板軟骨是椎間盤重要的營養(yǎng)途徑，終板軟骨退變可導(dǎo)致椎間盤退變，研究表明終板軟骨退變早于椎間盤退變[7]。軟骨終板的生化組成對維持椎間盤的完整性至關(guān)重要，其蛋白濃度具有調(diào)節(jié)向椎間盤進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸?shù)哪芰Γ浌墙K板的蛋白多糖減少可引起髓核的蛋白多糖含量下降。營養(yǎng)物質(zhì)通過軟骨終板的能力取決于兩個主要方面[8，9]:①溶質(zhì)的形狀大小和電荷，分子量越大，滲透率越低，滲透越慢，球形分子比長鏈分子易于通過;②軟骨終板的自身成分，含水越多，滲透率越高，滲透速度也越快，而膠原增多和軟骨鈣化則會降低濾過能力，軟骨終板的滲透性發(fā)生改變，椎間盤內(nèi)的物質(zhì)交換會明顯減少。本實(shí)驗(yàn)采用徐宏光創(chuàng)建的體外終板軟骨細(xì)胞自然退變模型[10]，選取P1代細(xì)胞與P5代細(xì)胞，通過Real-time RT-PCR檢測終板軟骨表型基因改變，研究發(fā)現(xiàn)顯示Ⅱ型膠原較原代終板軟骨細(xì)胞表達(dá)下調(diào)2倍，蛋白多糖下調(diào)2.5倍。結(jié)果符合模型研究。

Asporin基因由Lorenzo等在2001年發(fā)現(xiàn)，ASPN是小的富含亮氨酸的蛋白多糖家族成員。在其N端它含有一個獨(dú)特的D重復(fù)的片段，這個片段具有多態(tài)性，等位基因D的數(shù)量不等，范圍9～20。由于Asporin蛋白在其氨基端有一獨(dú)有的asparstate重復(fù)序列及其同decoin(DCN)相似，故把它命名為Asporin，與deeoin和biglyean同屬于SLRP家族的第一類成員。人類的 Asporin蛋白同 decoin(neN)和biglyean(BGN)約有50%的一致性 (和70% 相似性)[11]。

Asporin基因在骨關(guān)節(jié)炎中廣泛研究，2005年Kizawa等首次在日本人群中發(fā)現(xiàn)Asporin基因中的天冬氨酸序列多態(tài)性與骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)，經(jīng)對候選基因的關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，與最常見的D13等位基因相比，D14等位基因在膝骨關(guān)節(jié)炎和髖骨關(guān)節(jié)炎人群中表達(dá)頻率明顯較高[12]。骨性關(guān)節(jié)炎 (OA)和腰椎間盤退變 (LDD)有著相同的發(fā)病機(jī)制，均是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白含量的下降。Asporin蛋白也被認(rèn)為是PLAP-1(牙周膜聯(lián)合蛋白-1)，其特異表達(dá)在牙周膜 (PDL)，PDL是位于牙根和牙槽骨之間的結(jié)締組織，它連接牙齒與牙槽骨并為牙周組織提供營養(yǎng)，保持牙周內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和起修復(fù)作用[13]。Asporin基因在椎間盤退變中也有所研究[14]。研究表明Asporin基因在人退變椎間盤細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，與椎間盤退變呈正比[15]。

本實(shí)驗(yàn)通過椎間盤體外退變模型，利用Western blot檢測Asporin基因的變化，發(fā)現(xiàn)退變的P5代終板軟骨細(xì)胞內(nèi)Asporin蛋白水平表達(dá)較P1代細(xì)胞明顯上調(diào)，與之前研究相同。

Asporin基因通過與生長因子相互作用而影響骨與軟骨的形成與分化，與椎間盤退變密切相關(guān)。Asporin基因可與 (TGF)β1形成功能性反饋環(huán)，即 (TGF)β1誘導(dǎo)Asporin基因表達(dá)，Asporin基因抑制 (TGF)β1介導(dǎo)的軟骨基質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)[4，15]。內(nèi)源性轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF) β1是一種具有多種生理功能的多肽細(xì)胞因子，能促進(jìn)軟骨細(xì)胞、椎間盤細(xì)胞中蛋白多糖及Ⅱ型膠原合成和延緩軟骨的自然退變進(jìn)程[16]。徐宏光等之前研究表明，退變的終板軟骨細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1較正常表達(dá)明顯下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)Asporin抑制 (TGF)β1信號通路是通過與 (TGF)β1相結(jié)合，從而阻止 (TGF)β1與Ⅱ型膠原的 (TGF)β1受體相互作用[3]。因此，我們可以認(rèn)為，退變軟骨終板內(nèi)蛋白多糖及Ⅱ型膠原表達(dá)下調(diào)可能與兩個因素有關(guān):①退變終板軟骨細(xì)胞內(nèi) (TGF)β1表達(dá)下調(diào)。②Asporin蛋白與 (TGF)β1相結(jié)合，從而阻止 (TGF)β1調(diào)控蛋白多糖及Ⅱ型膠原表達(dá)。Asporin蛋白在國內(nèi)與國外主要集中在膝髖等關(guān)節(jié)炎的研究，在膝、髖關(guān)節(jié)炎節(jié)軟骨中表達(dá)顯著增加，有少量在椎間盤內(nèi)進(jìn)行研究，然后對終板軟骨細(xì)胞內(nèi)Asporin基因研究甚少。本研究主要是檢測在退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞內(nèi)Asporin蛋白表達(dá)情況，且發(fā)現(xiàn)隨著終板軟骨發(fā)生退變，Asporin基因表達(dá)明顯上調(diào)，從而為椎間盤退變機(jī)制及治療研究提供新的方向。提示調(diào)節(jié)Asporin基因在終板軟骨中的表達(dá)有可能會阻止椎間盤的退變。

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