王善金 李新鋒 戴力揚(yáng)

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院骨科，上海200092)

骺板 (epiphyseal plate)又稱為生長板 (growth plate)，是中胚層來源的高度分化的軟骨結(jié)構(gòu)。長骨的線性生長由生長板軟骨內(nèi)成骨實(shí)現(xiàn)。生長板內(nèi)軟骨細(xì)胞的生長經(jīng)歷靜止、增殖、分化和凋亡的有序過程，從組織學(xué)上可分為靜止層、增殖層、肥大層和礦化層。靜止軟骨細(xì)胞不活躍，處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，是骺板幼稚軟骨細(xì)胞的源泉，又稱細(xì)胞生發(fā)層;增殖細(xì)胞層堆積成柱狀，柱的排列與骨的縱軸相平行，細(xì)胞生長活躍，數(shù)目多，有豐富的軟骨基質(zhì)和膠原纖維，以Ⅱ型膠原、蛋白聚糖為主;肥大層細(xì)胞體積變大、變圓，軟骨基質(zhì)明顯減少，以X型膠原為主，這部分是骺板最薄弱的部位;礦化層很薄，僅有一層或幾層細(xì)胞構(gòu)成，軟骨細(xì)胞凋亡，基質(zhì)鈣化，新生血管和骨細(xì)胞前體侵入并將肥大層內(nèi)軟骨改建形成新骨。這一過程是在多種內(nèi)分泌因素的直接和 (或)間接控制下完成的，這些因素包括糖皮質(zhì)激素、甲狀腺激素、性激素、瘦素等。骺板區(qū)生長代謝活躍，易受體內(nèi)外多種不良因素的影響，引起生長板軟骨細(xì)胞增殖、生長、鈣化障礙，最終導(dǎo)致肢體短縮和 (或)成角畸形或過度生長。

瘦素和雌激素是人體內(nèi)重要的激素內(nèi)物質(zhì)，和不同性別個(gè)體的生長發(fā)育都有密切的關(guān)系。近年來，對(duì)雌激素和瘦素在生長板軟骨內(nèi)化骨過程中的機(jī)制研究日益增多，本文對(duì)兩者的作用及相互關(guān)系作一綜述。

1 雌激素與生長板

雌激素是主要的女性性激素，主要由卵巢分泌或者雄性激素經(jīng)芳香酶轉(zhuǎn)化而來。在長骨的生長發(fā)育中，雌激素發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，可以引起青春期長骨的快速生長和后期骺板的融合，雌激素受體或者芳香酶的變異可以導(dǎo)致身高的異常[1]。雌激素對(duì)骨生長的作用分為兩方面，一是系統(tǒng)性作用，即通過調(diào)節(jié)生長激素 (GH)/胰島素樣生長因子-I(IGF-I)軸來實(shí)現(xiàn);二是直接作用與生長板內(nèi)軟骨細(xì)胞來調(diào)節(jié)生長[1]。

雌激素的直接作用主要分為基因組和非基因組效應(yīng)?；蚪M效應(yīng)是通過雌激素受體激活雌激素反應(yīng)元件 (estrogen response element)完成的。雌激素受體 (ER)是核受體超家族的成員，介導(dǎo)雌激素的效應(yīng)，主要分兩種亞型:ERα和ERβ。研究發(fā)現(xiàn) 人和動(dòng)物的生長板軟骨細(xì)胞中存在雌激素受體的表達(dá)，表明雌激素對(duì)生長板軟骨細(xì)胞的直接作用。ERα和ERβ在各個(gè)細(xì)胞層均有表達(dá)以增生層表達(dá)高，與年齡點(diǎn)相關(guān)呈動(dòng)態(tài)變化，并受體內(nèi)激素水平調(diào)節(jié)[2]，提示受體表達(dá)動(dòng)態(tài)變化有功能性意義。Yao等[2]研究發(fā)現(xiàn) ERα主要位于細(xì)胞質(zhì)中而ERβ主要位于細(xì)胞核中，說明不同的受體在細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)的通路傳導(dǎo)效應(yīng)不同。

ERα和ERβ介導(dǎo)著相反的作用，前者促進(jìn)骨生長，后者則有抑制作用。近來對(duì)雌激素受體敲除的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了ERα和ERβ在生長板中的不同作用。Chagin等[3]則發(fā)現(xiàn) ERβ敲除后抑制了生長板軟骨細(xì)胞的增殖。然而究竟哪個(gè)受體在生長板軟骨中起主導(dǎo)作用取決于性別和雌激素的濃度。青春期，高濃度的雌激素主要通過ERα來介導(dǎo)生長板融合[4]，相反有作者[5]認(rèn)為性成熟早期，ERα介導(dǎo)的作用并不重要。不同濃度的雌激素，ERβ介導(dǎo)的作用不同，低濃度時(shí)ERβ能抑制ERα介導(dǎo)的作用，而高濃度時(shí)，ERβ介導(dǎo)的作用得到增強(qiáng)，因此雌激素作用生長板最合適的劑量維持在一個(gè)很小的范圍內(nèi)，過高或者過低的濃度起到相似的作用[6]。雌激素的作用不僅跟劑量有關(guān)系，跟時(shí)間點(diǎn)也有關(guān)系。在青春期早期，長骨的增長與ERβ的激活有關(guān)系，而在青春期后期骨增長與ERα的激活有關(guān)系[7]。

由于ERα和ERβ介導(dǎo)的作用不同，雌激素對(duì)軟骨細(xì)胞增殖作用研究尚無定論。Simm等[8]通過雌激素受體拮抗劑作用于生長板細(xì)胞株(RCJ3.1C5.18)，研究發(fā)現(xiàn)拮抗ERα后致軟骨細(xì)胞增殖分化減弱，拮抗ERβ后致軟骨細(xì)胞增殖分化增強(qiáng)，說明ERα和ERβ在軟骨內(nèi)骨化中發(fā)揮著不同的作用。Talwar等[9]發(fā)現(xiàn)雌二醇 (10-8M)能夠顯著抑制大鼠生長板軟骨細(xì)胞的增殖促進(jìn)軟骨細(xì)胞的成熟。Takano[10]等通過去勢(shì)造成雌激素減少的兔模型，發(fā)現(xiàn)股骨生長板的軟骨細(xì)胞數(shù)目減少，caspase-3基因的活性增強(qiáng)，這可能是雌激素減少促進(jìn)細(xì)胞凋亡的結(jié)果。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)高濃度的雌激素能夠激活caspase-3基因的活性，說明雌激素介導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡過程[6]。最近發(fā)現(xiàn)雌激素調(diào)控生長板軟骨細(xì)胞的凋亡機(jī)制是通過線粒體通路而與MAPK和NO無關(guān)，但是調(diào)控細(xì)胞增殖是通過雌激素膜受體和MAPK信號(hào)通路[11]。

雌激素的非基因組效應(yīng)表現(xiàn)為激活了一些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路如 等 這些信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖分化有密切的關(guān)系。雌激素能夠調(diào)節(jié)雌性大鼠生長板軟骨細(xì)胞質(zhì)中的游離鈣濃度，而對(duì)雄性大鼠無明顯作用，這個(gè)作用是通過PKC依賴的IP3通路介導(dǎo)的[12]。McMillan 等[13]研究發(fā)現(xiàn)雌激素能激活大鼠生長板軟骨細(xì)胞的MAPK信號(hào)通路，不同的性別作用不同。

此外，雌激素調(diào)控生長板融合的機(jī)制至今不清楚。一般認(rèn)為雌激素能通過耗竭增生層的軟骨細(xì)胞來誘導(dǎo)生長板融合的[14]。Emons 等[15]發(fā)現(xiàn)雌激素能增加大鼠生長板內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)的表達(dá)，雌激素誘導(dǎo)的血管侵入也是生長板融合機(jī)制之一。Chagin等[16]發(fā)現(xiàn)大鼠生長板軟骨細(xì)胞可以自行合成雌激素，有促進(jìn)增殖抑制凋亡的作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體新的亞型GPR30，主要在靜止層和肥大層表達(dá)，與年齡變化有關(guān)系[17]，與ERs一樣能夠介導(dǎo)雌激素在生長板中的作用[18]。Ford等[19]發(fā)現(xiàn)GPR30敲除后能增加雄性小鼠生長板軟骨細(xì)胞的增殖能力。

2 瘦素與生長板

瘦素 (leptin)是肥胖基因 (Ob)的產(chǎn)物，是調(diào)節(jié)攝食和體重的激素類物質(zhì)，主要在白色脂肪組織中表達(dá)。瘦素在青春期早期發(fā)揮著啟動(dòng)促進(jìn)作用，并且在不同性別之間的作用有差異[20]。瘦素對(duì)長骨生長的作用分為直接作用和間接作用。間接作用是通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)下丘腦直接調(diào)控的。同時(shí)瘦素能直接調(diào)控生長板軟骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化，這個(gè)過程是通過瘦素受體 (leptin receptor)完成的。瘦素受體屬于I類細(xì)胞因子受體家族，有6種亞型，但是只有長型瘦素受體 (Ob-Rb)參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)[21]。研究發(fā)現(xiàn)瘦素受體可以表達(dá)在生長板軟骨細(xì)胞的各個(gè)細(xì)胞層，以肥大層為主[22，23]。Li等[23]能過免疫組化發(fā)現(xiàn)瘦素受體在大鼠生長板軟骨細(xì)胞中的表達(dá)和年齡及性別有關(guān)系，且在脊柱椎體生長板和四肢長骨生長板的表達(dá)也不同。

瘦素與瘦素受體結(jié)合后可以激活JAK/STAT、PI3K、MAPK等多種細(xì)胞通路，這些細(xì)胞通路被證實(shí)在軟骨內(nèi)骨化過程中發(fā)揮著重要作用[24]。瘦素調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖分化的機(jī)制至今未完全明了。ATDC5細(xì)胞在胰島素的誘導(dǎo)下可以分化成生長板軟骨細(xì)胞，不同的時(shí)間點(diǎn)具有不同的細(xì)胞層特點(diǎn)，是目前研究生長板機(jī)制最常用的細(xì)胞株。Ben-Eliezer等[25]發(fā)現(xiàn)瘦素通過激活ERK1/2和STAT3信號(hào)通路來增加ATDC5細(xì)胞中X型膠原的表達(dá)，而P38信號(hào)通路則沒有明顯的意義。瘦素的作用與劑量有關(guān)系，生理劑量的瘦素 (10 ng/ml)能增加ATDC5細(xì)胞內(nèi)X型膠原的表達(dá)，高劑量的瘦素 (100 ng/ml) 則減少了 X 型膠原的表達(dá)[22]。Kume等[26]認(rèn)為瘦素調(diào)控軟骨化骨的過程是通過調(diào)節(jié)生長板中的血管生成實(shí)現(xiàn)的。瘦素還可以增加PTHrP水平，并同時(shí)減少IHH水平[27]，通過這個(gè)反饋通路來調(diào)控細(xì)胞的增殖分化。Otero等[28]發(fā)現(xiàn)瘦素與干擾素γ在調(diào)控ATDC5細(xì)胞中NOS發(fā)揮協(xié)同作用，這個(gè)作用是通過PI-3K，MEK1 and p38信號(hào)通路。Wang等[29]也發(fā)現(xiàn)瘦素可以增加大鼠生長板內(nèi)甲狀腺激素受體 (TR-α)的表達(dá)，并與甲狀腺激素發(fā)揮協(xié)同作用，共同調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和分化。

瘦素缺乏的小鼠 (Ob小鼠)股骨生長板細(xì)胞凋亡增加，一定劑量的瘦素刺激后可以抑制凋亡[22]。瘦素受體缺乏的小鼠 (db小鼠)，脛骨長度較對(duì)照組短小，說明瘦素受體通路在生長板代謝中發(fā)揮重要作用[30]。瘦素對(duì)脊柱和四肢的骺板有著相反的作用。對(duì)瘦素缺乏的Ob小鼠研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于野生小鼠，ob小鼠股骨縮短，而脊柱變長，瘦素缺乏最初影響的是股骨的改變，后期才會(huì)影響到脊柱椎體[31]，提示椎體和四肢長骨骺板對(duì)leptin信號(hào)缺陷的反應(yīng)不同。

3 瘦素與雌激素的相互關(guān)系

青春發(fā)育期生物體內(nèi)常常會(huì)伴有諸多重要的生理變化，諸如生長加速、性發(fā)育成熟等。這些過程都需要保證體內(nèi)有充足的能量?jī)?chǔ)備，而瘦素和雌激素都是調(diào)節(jié)能量代謝的重要激素，瘦素能調(diào)節(jié)青春期的性成熟[32]。人體體脂組成呈現(xiàn)鮮明的性別差異性，這種差異性最初開始于青春發(fā)育期，雌激素和瘦素都是體脂組成的重要調(diào)解者，青春期女性體內(nèi)脂肪含量明顯高于男性，性激素是影響青春期的重要激素，脂肪細(xì)胞分泌的瘦素是青春期的準(zhǔn)入因子，女性進(jìn)入青春期的時(shí)間要明顯早于男性[33]。這些研究提示瘦素和雌激素在生長發(fā)育中可能存在某種相互關(guān)系。

目前已經(jīng)研究證實(shí)瘦素和雌激素在一些特定組織存在相互作用。Choi等[34]發(fā)現(xiàn)瘦素誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞的增殖也是通過ERα的表達(dá)和STAT3通路。Binai等[35]證實(shí)在乳腺癌細(xì)胞中，ERα能增加瘦素誘導(dǎo)的STAT3磷酸化水平，抑制ERα則降低瘦素誘導(dǎo)的STAT3磷酸化水平，而且這種作用與雌激素受體的配基是沒有關(guān)系的。Gambino等[36]發(fā)現(xiàn)雌二醇能夠增加胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的瘦素分泌，這個(gè)過程是通過ERα的表達(dá)和MAPK信號(hào)通路。Yi等[37]發(fā)現(xiàn)ERα能夠促進(jìn)瘦素的分泌，而ERβ能夠抑制瘦素的分泌，表明ERα與ERβ在瘦素分泌的過程中起著相反的作用。雌激素能夠上調(diào)大鼠背根神經(jīng)節(jié)的瘦素受體mRNA和蛋白的表達(dá)[38]。

圖1 瘦素與雌激素在細(xì)胞增殖中的相互作用關(guān)系

瘦素、雌激素及其相應(yīng)受體在骺板內(nèi)都有表達(dá)，而且表達(dá)部位類似，提示它們可能存在相互作用。Runx2(Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2)是軟骨細(xì)胞向肥大層分化的必需因子，并和雌激素和瘦素都有作用關(guān)系[39]。最近發(fā)現(xiàn)Wnt通路及其抑制因子Dickkopf-1(DKK1)也是骨發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)解信號(hào)，并且Wnt是 Ihh的下游靶點(diǎn)[40]。瘦素能增加骺板內(nèi)PTHrP，降低 Ihh，而且有年齡和部位依賴的特點(diǎn)[27]。雌激素可以刺激 Ihh及其靶向基因Ptc1等的表達(dá)。提示這些圍繞PTHrp-Ihh、Ihh-Wnt等信號(hào)軸的多種細(xì)胞因子同瘦素和雌激素都有一定關(guān)系，可能充當(dāng)兩者之間相互作用的媒介因子。

綜上所述，瘦素與雌激素的受體在生長板上存在共表達(dá)，兩者均能調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖、分化以在生長板中的相互作用研究比較少。研究二者的關(guān)系對(duì)闡明青春期骨發(fā)育的機(jī)制、防治骨生長有關(guān)的畸形有著重要的意義。及凋亡，而且作用于共同的媒介分子和相同的信號(hào)通路。這些結(jié)論都一定程度地揭示了瘦素和雌激素存在著某種相互關(guān)系，然而直接涉及瘦素與雌激素

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