潘茜 孫宏偉 王健 于丹 王守巖 高原 王瑩 王哲 關(guān)洪全 遼寧中醫(yī)藥大學(xué) （沈陽 110847）

0.引言

腦缺血再灌注損傷與腦組織的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[1-3]。炎癥介質(zhì)細胞間黏附因子1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)具有介導(dǎo)白細胞與血管內(nèi)皮細胞之間的黏附及白細胞穿過血管壁這一復(fù)雜過程的作用。正常情況下ICAM-1可在血管內(nèi)皮細胞處有較低水平表達,不會引起機體的病理性損傷;而在腦缺血等病理情況下,其表達可明顯升高,通

1.材料與方法

過促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，加重腦組織的損傷程度[4-6]。眼針療法是我院著名老中醫(yī)彭靜山教授于上世紀70年代始創(chuàng)，是以眼眶周圍穴區(qū)為針刺點進行防治疾病的一種微針療法。本研究通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷的動物模型，觀察眼針治療對大鼠海馬組織中ICAM-1表達量的影響,探究眼針治療腦缺血再灌注損傷的相關(guān)作用機制。

1.1 實驗動物與分組

健康SPF級SD大鼠64只，雌雄不拘，體重280±20克，由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證編號：SCXK（京）2007-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，自由飲水、攝取標準顆粒飼料，室內(nèi)溫度22?C，相對濕度45%。按隨機數(shù)字法將大鼠分為對照組、假手術(shù)組、模型組、眼針組4組，每組16只。

1.2 模型制備與評價

參照文獻[7]，模型組及眼針組采用改良的線栓法復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。具體如下，在室溫 (22?C) 條件下 ,大鼠用10%水合氯醛 (300mg/kg)腹腔注射麻醉后,仰臥固定于手術(shù)臺上,頸部消毒后正中偏右0.5cm處縱向切開2cm切口,分離右側(cè)頸總動脈(CCA) 、頸外動脈 (ECA) 、頸內(nèi)動脈 (ICA)。其中ECA需暴露出3～5mm, ICA需分離至翼腭動脈。在ECA遠端距CCA分叉處3～5mm處結(jié)扎ECA，注意：結(jié)扎用的手術(shù)線不要剪斷。再用電凝器在結(jié)扎點遠心端電凝ECA，用眼科手術(shù)剪在結(jié)扎點和電凝點之間剪斷ECA。然后將ECA向鼠尾方向牽拉，使ECA和 ICA成一條直線。動脈夾夾閉CCA 近心端和ICA遠心端,在ECA結(jié)扎點前端剪一“V”形小口,緩慢將栓塞線經(jīng)ECA插入ICA，打開ICA遠心端的動脈夾。栓塞線插入深度1.8cm至2.2cm。結(jié)扎ECA，逐層縫合。正常組未做處理。假手術(shù)組術(shù)式同缺血再灌注模型組、眼針組，僅未插入釣魚線。模型組、眼針組于缺血2 h進行再灌注，再灌注后72 h進行神經(jīng)功能缺損評分。模型的評價參照ZeaLonga 5分制評分標準：①0分為無癥狀；②1分為不能完全伸展對側(cè)前爪；③2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；④3分為向?qū)?cè)傾倒；⑤4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實驗組，未達標準者排除。

1.3 眼針取穴及刺法

取13mm毫針，眼針組于大鼠眶周2mm處針刺，定位參照人體取穴方法[8,9]，取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)，見圖1。針刺手法：從眼眶邊緣1mm部位平刺，左眼按照順時針方向（右側(cè)按逆時針方向），從該穴區(qū)起始定位線向終止定位線進針，進行平刺操作，刺入真皮，達到皮下組織，進針3mm，到終止定位線為止。留針20min，留針10min時用刮柄進行刮針1次，刮針5下。治療時機：眼針組于腦缺血再灌注即刻及取材前30min分別進行眼針治療2次。正常組、假手術(shù)組和模型組無其他處理。

1.4 試劑

圖1.大鼠眼針取穴示意圖

實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa大連寶生物。ICAM引物由北京華大基因公司合成。親和純化兔抗鼠ICAM多克隆抗體、DAB染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.5 指標測定

海馬組織ICAM蛋白表達（Western blot法）：于缺血再灌注損傷3h對大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭取出腦組織，去掉小腦，沿兩側(cè)大腦半球連接處將大腦半球切開，剝離出病變側(cè)海馬，按組織凈重:裂解液=1:10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液，PH值為7.5，將樣品剪碎后勻漿、離心，上清即為總蛋白。兔抗鼠ICAM一抗（1:500）；O–dianidine,β-naphthyl acid phosphate顯色；掃描儀掃描NC膜，分析結(jié)果。

海馬組織ICAM mRNA的表達采用RQ-PCR方 法：ICAM上 游 引 物：5'CAAACGGGAGATGAATGG 3'；下游引物：5'CACGAAGCCCGCAAT3'。β-actin為內(nèi)參，其上下游引物分別為:5' CGT GCGTGACATTAAAGAG 3'，5' TTGCCGATAGTGA TGACCT 3'。所有的產(chǎn)物，在ABI Prism 7500 HT序列檢測系統(tǒng)中運行。讀取CT 值，以管家基因β-actin 為內(nèi)參，以擴增倍數(shù)作為比較的依據(jù), △CT = CT目的基因-CTβ-actin , △△CT =△CT實驗- △CT對照,擴增倍數(shù)= 2 - △△CT。將所擴增的PCR產(chǎn)物同時進行溶解曲線分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理。

采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)均采用“ ±s ”表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05被認為有顯著性差異。

2.結(jié)果

2.1 眼針對急性腦缺血再灌注損傷3h后大鼠神經(jīng)缺損評分影響

模型組和眼針組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，如提尾時左側(cè)前肢不能伸直，行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒等；假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。模型組造模后即刻與眼針組造模后即刻及模型組再灌注損傷3h后神經(jīng)功能缺損評分無顯著差異，眼針組再灌注損傷3h后與造模后即刻神經(jīng)功能缺損評分有顯著差異（P＜ 0.01）。

表1. 眼針對腦缺血再灌注損傷3h后神經(jīng)缺損評分影響

表2.眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬組織ICAM-1蛋白表達影響

圖2.眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬組織ICAM-1mRNA表達影響注：△P＜0.01，與正常組比較，*P＜0.01，與模型組比較。

2.2 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬組織ICAM-1蛋白表達的影響

表2為采用Western blot方法檢測結(jié)果：取大鼠右側(cè)海馬組織檢測ICAM-1蛋白，以β-actin為內(nèi)參，模型組海馬組織ICAM-1蛋白表達明顯高于正常組和假手術(shù)組，眼針組ICAM-1蛋白表達明顯低于模型組（P＜0.01）。

2.3 眼針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬組織ICAM-1mRNA表達的影響

采用實時定量PCR方法檢測海馬組織ICAM-1mRNA表達的結(jié)果如圖2所示，本實驗選用β-actin作為內(nèi)參，ICAM基因擴增產(chǎn)物大小為86bp，β-actin基因擴增產(chǎn)物為132 bp。模型組腦組織ICAMmRNA表達較正常組、假手術(shù)組增加，眼針組表達較模型組減少，均有顯著差異（P＜0.01）。

3.討論

由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院著名老中醫(yī)彭靜山教授于上世紀70年代首創(chuàng)的眼針療法，是在眼眶周圍應(yīng)用針刺等刺激防治疾病的一種微針療法，用于臨床30余年來，療效顯著。研究表明腦缺血再灌注損傷的發(fā)生與腦組織缺血后發(fā)生炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[10]。細胞間黏附因子1(ICAM-1)屬免疫球蛋白超家族成員,與白細胞的浸潤關(guān)系密切，可促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本實驗通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，應(yīng)用Western blot、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RQ-PCR）方法測定海馬組織ICAM-1蛋白及mRNA表達的變化，觀察眼針治療對大鼠海馬組織中ICAM-1含量的影響,探究眼針治療腦缺血再灌注損傷的相關(guān)作用機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血再灌注損傷模型組和眼針組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙；模型組造模后即刻與眼針組造模后即刻及模型組再灌注損傷3小時后神經(jīng)功能缺損評分無顯著差異，眼針組再灌注損傷3小時后與造模后即刻神經(jīng)功能缺損評分有顯著差異（P＜0.01）。該結(jié)果表明眼針治療有助于改善大鼠腦缺血神經(jīng)功能損傷程度，利于大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。Western blot方法和實時定量PCR方法檢測結(jié)果表明，模型組海馬組織ICAM-1蛋白及mRNA表達水平明顯高于正常組和假手術(shù)組，眼針組ICAM-1蛋白及mRNA表達明顯低于模型組（P＜0.01）。該結(jié)果表明經(jīng)眼針治療后，腦缺血再灌注損傷大鼠海馬組織中ICAM-1含量明顯降低，同時大鼠神經(jīng)功能缺損程度降低。

本研究結(jié)果表明腦缺血再灌注損傷后，大鼠海馬組織可通過增加 ICAM-1的表達量，進一步促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，加重腦組織的損傷，致使大鼠出現(xiàn)如提尾時左側(cè)前肢不能伸直, 行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒等神經(jīng)功能缺損的癥狀。應(yīng)用眼針的治療方法，可通過降低腦缺血再灌注后大鼠海馬組織中ICAM-1的含量，抑制白細胞在血管內(nèi)皮上的黏附,減輕炎性反應(yīng)的發(fā)生，使大鼠神經(jīng)功能缺損的癥狀得到緩解。

腦缺血早期的炎癥反應(yīng)對于缺血性腦損傷的最終范圍和程度的影響具有重要意義[11]。本研究通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的動物模型，揭示了“眼針療法”治療中風(fēng)病與炎癥相關(guān)的部分作用機制，為發(fā)揮針灸防治常見病作用，進一步完善“眼針療法”提供一定的理論依據(jù)。

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