白 莉 張新光 吳 杰 朱慧華 趙毅濤 張曉峰 虞堅(jiān)爾

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海市閘北區(qū)芷江中路274號(hào)，200071;2上海市中醫(yī)藥研究院中醫(yī)兒科研究所;3上海中醫(yī)藥大學(xué);4廣東省中醫(yī)院)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞，包括炎性細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)、氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞(氣道平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病［1］。近年來(lái)研究認(rèn)為，輔助性T淋巴細(xì)胞兩種亞型Th1/Th2的失衡是哮喘發(fā)病最重要的免疫學(xué)機(jī)制［2］。正常情況下，Thl和Th2細(xì)胞處于相對(duì)平衡狀態(tài)，維持機(jī)體正常的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。當(dāng)機(jī)體受到異?？乖碳r(shí)，上述這種平衡被打破，Thl、Th2發(fā)生偏向，即可導(dǎo)致與Thl和Th2型反應(yīng)相關(guān)的一些變應(yīng)性疾病的發(fā)生、發(fā)展［3］。平喘方既針對(duì)哮喘發(fā)病之本——伏痰夙瘀，又降氣平喘治標(biāo)，是治療哮喘的一劑良方。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察平喘方對(duì)支氣管哮喘模型小鼠Thl/Th2上游因子T－bet/GATA－3 mRNA表達(dá)的影響，研究其對(duì)支氣管哮喘發(fā)病過(guò)程作用環(huán)節(jié)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性BALB/c小鼠120只，4～6周齡，體重18～22g，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 卵清白蛋白(Ovalbumins.OVA)購(gòu)自上海伯奧生物科技有限公司;結(jié)晶氯化鋁(AlCl3·6H2O)、氫氧化鈉(NaOH)購(gòu)自上海美興化工有限公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)購(gòu)自上海生物工程技術(shù)公司;DEPC處理水購(gòu)自上海賽百盛基因公司;TRIZOLTM購(gòu)自聯(lián)合生物集團(tuán)公司;GATA－3及T－bet單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司。氯仿HPLC級(jí)購(gòu)自上海試劑一廠;異丙醇HPLC級(jí)購(gòu)自蘇州振亞化工廠;無(wú)水乙醇AR級(jí)購(gòu)自上海振興化工一廠;FQPCR試劑盒購(gòu)自上海達(dá)為科生物科技有限公司。壓縮噴霧治療儀(Eurosol Aerosol Apparatus)，意大利梅法;旋渦振蕩器(Vortex)XW－80A，上海青浦瀘西儀器廠;干式恒溫器(K10CD)，杭州藍(lán)焰科技有限公司;－80℃低溫冰箱，日本三洋;－20℃冷藏冰箱，伊來(lái)克斯BDC－280e);低溫冷凍離心機(jī)(1 15K3K15)，Sigma(美國(guó));生物安全柜(TYPE B2)，Sigma(美國(guó));紫外殺毒車(ZXC型)，上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠;Real－time檢測(cè)儀(7300Sequence Detection System)ABI－7500，ABI(美國(guó))。

1.3 藥物及制備方法 平喘方由炙麻黃、苦杏仁、炙紫蘇子、萊菔子、大桃仁、淡黃芩等藥組成。拆方1由炙麻黃、苦杏仁、大桃仁等組成;拆方2由炙麻黃、大桃仁等組成;拆方3由炙麻黃、炙紫蘇子等組成。中藥煎煮提取方法參考李儀奎［4］等的方法，第一次加13倍水旺火煮沸后，溫火煮1h，保溫2h，將藥液濾出。第二次加入11倍水旺火煮沸后，溫火煮1h，保溫2h，將藥液濾出。濾液合并濃縮，加入95%乙醇適量［依公式V 60/(95－60)計(jì)算］，冷藏靜置24h。濾出將濾液濃縮至流浸膏樣，配制至濃度為含生藥量5.33g/mL。由上海市中醫(yī)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室制備。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 將120只清潔級(jí)雄性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為6組:對(duì)照組、模型組、平喘方組、拆方1組、拆方2組、拆方3組。

2.2 造模方法 根據(jù)課題組成熟的動(dòng)物模型［5］，采用OVA和Al(OH)3加入生理鹽水腹腔注射致敏，造成支氣管哮喘小鼠模型。將OVA溶于生理鹽水配置10%濃度的致敏液，用前即時(shí)配置。除對(duì)照組外，每只小鼠分別于第1天和第14天以O(shè)VA、Al(OH)3和生理鹽水配置成10%OVA生理鹽水混合液1mL，腹腔注射致敏;第26天至第32天，每天將各組小鼠置于5L密閉容器中，以5%OVA生理鹽水，由超聲霧化器霧化吸入40min，激發(fā)哮喘，每d1次，共7d。對(duì)照組均以等量生理鹽水進(jìn)行腹腔注射和霧化吸入。

2.3 給藥方法 各組均普通喂養(yǎng)。各組于致敏2周后開(kāi)始用藥，每日1次，共4周。將中藥配制成5.33g濃度，平喘方組及拆方組以中藥0.4mL/20g鼠(50g/kg·d)灌胃，對(duì)照組和模型組以等量純水灌胃。

2.4 檢測(cè)項(xiàng)目 各組分別于霧化激發(fā)哮喘后7d、21d，分兩批處死、取樣、檢測(cè)，作動(dòng)態(tài)觀察。每時(shí)間節(jié)點(diǎn)每組分別取肺尖組織于凍存管，置于－80℃冰箱，采用RT－PCR檢測(cè)小鼠肺組織T－bet、GATA－3 mRNA的表達(dá);取左肺中葉，垂直于氣道取材，制肺組織切片，10%甲醛固定，用光鏡(HE染色)檢測(cè)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以s表示，用One－Way Anova程序中Homogeneity－of－variance進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如方差齊則直接進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD程序進(jìn)行兩兩比較;如方差不齊，用Transform程序中(Lg10+1)進(jìn)行變量變換后，再用One－Way Anova程序進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD程序進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié)果

3.1 一般結(jié)果 模型組小鼠經(jīng)腹腔致敏后，即出現(xiàn)體重下降;經(jīng)抗原激發(fā)后，出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁、毛發(fā)豎起、活動(dòng)與飲食減少等癥狀，嚴(yán)重者口鼻輕度發(fā)紺;對(duì)照組呼吸平穩(wěn)、皮毛光滑、活動(dòng)敏捷、飲食正常、體重增加;平喘方及拆方1、2、3組小鼠毛色光澤，活動(dòng)自如，飲食如常，體重增加。

3.2 小鼠肺組織T－bet、GATA－3 mRNA的表達(dá)如表1，哮喘激發(fā)7d后，與對(duì)照組比較:模型組T－bet明顯降低(P＜0.05)，GATA－3明顯升高(P＜0.05);T－bet/GATA－3比值明顯降低(P＜0.05);拆方1、2、3組GATA－3升高(P＜0.01或P＜0.05);拆方1組T－bet/GATA－3比值降低(P＜0.05)。與模型組比較:拆方1、2、3組 T －bet升高(P ＜0.05);平喘方組和拆方2、3組GATA－3降低(P＜0.05);拆方3組T－bet/GATA－3比值升高(P＜0.05)。用藥各組間比較，平喘方與拆方1、2、3組以及拆方各組之間T－bet無(wú)明顯差異。拆方1組GATA－3較平喘方及拆方2、3組升高(P＜0.05或P＜0.01)。拆方3組T－bet/GATA－3比值較拆方1組升高(P＜0.05);平喘方組、拆方2組T－bet/GATA－3比值均與其他組無(wú)明顯差異。如表2，哮喘激發(fā)21d后，與對(duì)照組比較:模型組T－bet明顯降低(P＜0.01)，GATA－3明顯升高(P＜0.01)，T－bet/GATA－3比值明顯降低(P＜0.01)。平喘方組以及拆方1、2、3組T－bet降低(P＜0.01);平喘方組GATA－3略為降低(P＜0.05);拆方1、2、3組T－bet/GATA－3比值降低(P＜0.01或P＜0.05)。與模型組比較:平喘方及拆方1、2、3組T－bet升高(P＜0.01)，GATA－3降低(P＜0.01)，T－bet/GATA －3比值升高(P＜0.01)。用藥各組間比較，拆方1組T－bet低于平喘方組、拆方3組(P＜0.05)，拆方2組低于拆方3組(P＜0.05);拆方1組GATA－3與平喘方組、拆方2、3組相比升高(P＜0.05);T－bet/GATA－3比值拆方1組低于其他各組(P＜0.05或P＜0.01)，而平喘方與拆方2、3組無(wú)顯著差異。

表1 激發(fā)7d BALB/c小鼠轉(zhuǎn)錄因子T－bet與GATA－3的表達(dá)(s，n=10)

表1 激發(fā)7d BALB/c小鼠轉(zhuǎn)錄因子T－bet與GATA－3的表達(dá)(s，n=10)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01。

組別 T－bet(%)GATA－3(%)T－bet/GATA－3(%)5.50±3.25 0.36±0.15 18.07±13.18模型組 0.88±0.50＊＊ 3.13±1.79＊＊ 0.47±0.50＊＊平喘方組 2.14±1.12 0.59±0.35▲▲ 10.38±7.13拆方1組 1.80±0.66▲▲ 2.01±0.79＊＊ 1.09±0.66＊＊拆方2組 3.24±1.75▲▲ 0.90±0.32＊＊▲▲ 4.10±3.05拆方3組 2.41±1.15▲▲ 0.73±0.27＊＊▲▲ 3.71±2.18對(duì)照組▲▲

表2 激發(fā)21d BALB/c小鼠轉(zhuǎn)錄因子T－bet與GATA－3的表達(dá)(s，n=10)

表2 激發(fā)21d BALB/c小鼠轉(zhuǎn)錄因子T－bet與GATA－3的表達(dá)(s，n=10)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，△△P＜0.01。

組別 T－bet(%)GATA－3(%)T－bet/GATA－3(%)9.11±3.09 0.95±0.68 28.50±11.52模型組 1.01±0.66＊＊ 4.52±3.61＊＊ 0.48±0.42＊＊△△平喘方組 3.43±2.90＊＊△△ 0.55±0.39＊△△ 13.48±12.63△△拆方1組 1.77±0.54＊＊△△ 1.44±0.82＊＊△△ 1.06±0.60△△拆方2組 2.05±0.87＊＊△△ 0.71±0.50＊＊△△ 2.59±1.46△△拆方3組 3.40±1.62＊＊△△ 0.71±0.29＊△△ 5.23±2.90對(duì)照組△△

3.3 小鼠肺組織切片病理檢測(cè) 對(duì)照組小鼠肺內(nèi)細(xì)支氣管上皮完整，管壁上皮、肌層及管周均為正常肺組織。哮喘激發(fā)7d后，模型組小鼠肺內(nèi)細(xì)支氣管壁黏膜上皮部分損傷脫落，管腔內(nèi)見(jiàn)炎性滲出物充塞和脫落的黏膜上皮細(xì)胞，管壁及管周大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);平喘方組小鼠肺內(nèi)細(xì)支氣管未見(jiàn)明顯改變，僅見(jiàn)管周炎細(xì)胞浸潤(rùn);拆方1組僅見(jiàn)管周淋巴組織增生;拆方2組部分細(xì)支氣管腔內(nèi)少量炎性滲出物;拆方3組僅見(jiàn)管周淋巴組織增生。哮喘激發(fā)21d后，模型組小鼠細(xì)支氣管大部分黏膜上皮細(xì)胞損傷脫落，管壁平滑肌部分破壞。管腔內(nèi)炎性滲出物充塞，管壁及管周大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。平喘方組為正常細(xì)支氣管、肺組織，管壁及管周炎細(xì)胞浸潤(rùn);拆方1組僅見(jiàn)管周淋巴組織增生;拆方2組正常細(xì)支氣管、肺組織，管周少量炎細(xì)胞浸潤(rùn);拆方3組僅見(jiàn)管周少量淋巴組織增生。

4 討論

Th1/Th2細(xì)胞平衡失調(diào)，機(jī)體正常的免疫耐受功能受損，是哮喘發(fā)病最重要的免疫學(xué)機(jī)制［6］。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子的選擇性表達(dá)是對(duì)Th細(xì)胞定向分化起關(guān)鍵作用的調(diào)控因素，其中T－bet和GATA－3分別控制原初性T細(xì)胞向Thl和Th2的定向分化［7］。轉(zhuǎn)錄因子T－bet/GATA－3失衡表達(dá)與氣道炎癥密切相關(guān)，能客觀反應(yīng)哮喘免疫失衡，很可能是哮喘氣道炎癥形成的重要原因之一［8］。多項(xiàng)研究表明，哮喘患兒T－bet mRNA表達(dá)水平與Thl百分率呈正相關(guān)，與Th2百分率呈負(fù)相關(guān);而GATA－3 mRNA水平與Th2百分率呈正相關(guān)，與Thl百分率呈負(fù)相關(guān);且T－bet/GATA－3 mRNA比值與Thl/Th2比值呈正相關(guān)［9］。通過(guò)對(duì)T－bet/GATA－3關(guān)鍵調(diào)控因子的研究，促使T－bet/GATA－3趨向平衡，能夠早期阻止上皮下纖維化形成等早期氣道結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)一步改善氣流受限，從而為靶向治療哮喘提供新策略［10］。因此，我們通過(guò)哮喘動(dòng)物模型觀察轉(zhuǎn)錄因子T－bet/GATA－3表達(dá)的變化，探討平喘方及其拆方對(duì)哮喘的防治作用，為中醫(yī)藥創(chuàng)新和推廣提供實(shí)驗(yàn)資料。

哮喘屬中醫(yī)“哮證”“喘證”“咳嗽”等范疇。哮喘是內(nèi)外因相互作用的結(jié)果，其發(fā)作內(nèi)因責(zé)之“正氣虛弱”“痰瘀伏肺”，外因多責(zé)之外邪、異氣、飲食等多種因素。宿痰為哮喘發(fā)病之夙根，瘀血是哮喘遷延不愈的重要因素，痰瘀互結(jié)導(dǎo)致哮喘反復(fù)發(fā)作［11］。虞堅(jiān)爾教授在三十余年的臨床實(shí)踐中，承前人之理，立化痰祛瘀平喘法，創(chuàng)平喘方，取得很好的效果。平喘方立足于哮喘發(fā)病之本——“伏痰”，標(biāo)本兼治，宣肺降氣以定其喘，化痰以針對(duì)其病本，病久必瘀，兼化瘀以撼其根，以達(dá)平喘之目的。平喘方以炙麻黃味辛、微苦，性溫，為肺經(jīng)要藥，能宣肺平喘為君;以萊菔子、紫蘇子、杏仁化痰，桃仁祛瘀為臣;佐以地龍干、椒目、黃芩，使以甘草。諸藥相配，共奏化痰祛瘀、降氣平喘之效［12］。拆方1祛痰化瘀;拆方2化瘀為主，寒熱平調(diào);拆方3祛痰為主，兼以宣肺降氣，寒熱平調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型小鼠肺組織T－bet mRNA的表達(dá)明顯降低，GATA－3 mRNA的表達(dá)明顯升高，T－bet/GATA－3表達(dá)失衡。平喘方及拆方各組均能不同程度地調(diào)節(jié)支氣管哮喘小鼠Th1/Th2上游因子T－bet/GATA－3 mRNA的表達(dá)，對(duì)Th1/Th2細(xì)胞的失衡有糾正作用。其中，對(duì)T－bet/GATA－3 mRNA的調(diào)節(jié)，激發(fā)7d拆方3組較好，對(duì)于Th1/Th2失衡具有雙向糾偏的作用，與平喘方組接近。激發(fā)21d平喘方組較佳。

平喘方及拆方各組均能減輕氣道黏膜上皮損傷，減少氣道炎細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕支氣管壁及周圍間質(zhì)充血水腫，對(duì)減輕哮喘發(fā)病癥狀，降低氣道高反應(yīng)性，改善哮喘氣道炎癥有明顯的作用，其中，拆方3組療效療效接近平喘方原方組，說(shuō)明平喘方是可以精簡(jiǎn)的。對(duì)平喘方進(jìn)行拆方研究，有助于闡明中藥復(fù)方的配伍組成原理及作用機(jī)制，為指導(dǎo)臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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