楊 帆 張建佚 周 林 宋玉國 張吉林 朱小泉 張玉榮 黃慈波 霍正浩 楊 澤

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)屬類風濕因子陰性慢性進行性炎性疾病，主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)及中軸骨骼，也可累及髖關(guān)節(jié)、外周關(guān)節(jié)及韌帶附著點等，可引起椎間盤纖維環(huán)及其附近韌帶鈣化和骨性強直。此病炎癥高度活動和低度活動相交替，好發(fā)于青少年，發(fā)病者多為10～40歲的男性。黃種人中發(fā)病率為0.2% ～0.5%，男性患者多于女性患者，男女比例為10∶1［1］。強直性脊柱炎的病因及發(fā)病機制尚不清楚，目前普遍認為是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。

STAT4屬轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)家族，主要被 IL－12激活，在 Th1/Th2的分化調(diào)控及因其失調(diào)引發(fā)的各種炎癥性疾病中有重要的作用。STAT4是Th1細胞發(fā)育必不可少的，若STAT4缺失可減輕T細胞介導的炎癥反應(yīng)。在實驗性變態(tài)反應(yīng)腦脊髓炎、關(guān)節(jié)炎、大腸炎、心肌炎及非肥胖型糖尿病小鼠模型實驗中，與野生型小鼠相比，STAT4缺陷小鼠的炎癥反應(yīng)更輕，且發(fā)病率更低［2，3］。

我們希望通過觀察STAT4基因上rs7574865、rs8179673、rs10181656和rs7582694在吉林強直性脊柱炎患者及正常對照人群之間的分布頻率，以探討 rs7574865、rs8179673、rs7582694和rs10181656與吉林人群強直性脊柱炎患病風險之間的關(guān)聯(lián)。

1.材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究對象 強直性脊柱炎患者來自北華大學附屬醫(yī)院檢驗中心，其中男性40名，女性16名，共56名，男女性別比約2∶1，年齡范圍(14～44)歲，平均年齡24歲;56名對照血液標本來自吉林地區(qū)的無血緣關(guān)系的健康正常人群，男性43名，女性13名，年齡范圍(39～72)歲，平均年齡46歲。所有病例均符合1985年修訂的紐約診斷標準［4］。所有研究對象均對該檢測項目知情同意，并提供外周血用于實驗。

1.1.2 主要試劑 全基因組DNA提取試劑盒購自Bio Chain公司;Taq DNA聚合酶和dNTP購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司;LC－Green Plus飽和熒光染料購自美國Idaho公司;限制性內(nèi)切酶購自MBI Fermentas公司。引物由上海生工生物技術(shù)開發(fā)有限公司合成;基因測序由華大基因測序部完成。

1.1.3 主要儀器 PCR擴增儀為美國MJ公司的PTC－225型PCR儀;高分辨熔解曲線(HRM)基因突變/基因分型檢測系統(tǒng)為美國Idaho公司Lightscanner TMHR－I 96;DNA定量分析儀為德國Eppendorf公司的Biophotometer蛋白/核酸比色儀。凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio－Rad公司的Gel DOC－2000成像系統(tǒng)。離心機為美國Beckman公司的Allegra TM 21R型離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及定量 取EDTA抗凝的受試者外周血0.5ml，用全基因組DNA提取試劑盒抽提DNA，通過蛋白/核酸比色儀對提取的基因組DNA進行濃度和純度的分析。根據(jù)測定結(jié)果將樣本DNA稀釋至20μg/μl的工作液置于4℃冰箱。

1.2.2 基因分型方法 采用聚合酶鏈式反應(yīng)－高分辨率熔解曲線(PCR－HRM)及聚合酶鏈式反應(yīng)－限制性位點多態(tài)性(PCR－RFLP)技術(shù)，并結(jié)合測序驗證分型結(jié)果。rs7574865、rs8179673和rs7582694位點用PCR－HRM技術(shù)進行分型，rs10181656位點用傳統(tǒng)的 PCR－RFLP技術(shù)進行分型。

1.2.3 引物合成 從Genebank中查得這4個SNPs位點上下游序列，通過Oligo 6.0和Primer5.0軟件設(shè)計引物。rs7574865引物序列為:F:5'－AATTACATGAGTGTGTATGCAGTAAA －3'，R:5'－CCCTGAAATTCCACTGAAATAAGAT －3';rs8179673引物序列為:F:5'－CTGCCATAGAAGTCTTTGAAGC－3'，R:5'－GATGATGATGTGTATGGTGGTT－3';rs10181656引物序列為:F:5'－ACTGTGATAGATAACTAGCTGGAAT－3'，R:5'－AAAGCAGGGAACGAGGAAGAT－3';rs7582694引物序列為:F:5'－CCTTCCAATGGTTTCTCATTTCAA －3'，R:5'－ AAAGAACAAGCAAACATGCATAG －3';低溫內(nèi)參:F:5'－TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAATATAATA － 3'，R:5'－ TATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA－3';高溫內(nèi)參:F:5'－GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGG －3'，R:5'－CCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC－3'。寡核苷酸內(nèi)參末端用C3封閉，以阻止延伸反應(yīng)。

1.2.4 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系均為10μl。HRM用PCR 體系含:模板 DNA 1μl，10 × PCR Buffer 1μl，dNTP(10mmol/L)0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，上下游引物各(10pmol/μl)0.1μl，上下游高低溫內(nèi)參各 0.05μl，1 × LC－Green Plus飽和熒光染料 1μl及雙蒸水 6.2μl。RFLP 用PCR 體系包含:模板 DNA 1μl，10 × PCR Buffer 1μl，dNTP(10mmol/L)0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，上下游引物各0.1μl及雙蒸水7.4μl。PCR反應(yīng)條件為:95℃預變性5min后進入主循環(huán)，95℃變性30s，退火，72℃延伸(rs7574865退火溫度為61℃，退火時間為20s，延伸時間為7s;rs8179673退火溫度為 52℃，退火時間為 25s，延伸時間為 12s;rs10181656退火溫度為61℃，退火時間為30s，延伸時間為30s;rs7582694退火溫度為53℃，退火時間為25s，延伸時間為12s)，總共35個循環(huán)，完成后72℃延伸7min。之后用HRM技術(shù)分型的樣本需進行變性和復性處理，程序為:95℃ 30s，25℃ 2min，94℃ 30s，24℃ 4min。rs7574865 PCR 擴增產(chǎn)物長56bp，rs8179673 PCR擴增產(chǎn)物長104bp，rs10181656 PCR擴增產(chǎn)物長101bp，rs7582694 PCR擴增產(chǎn)物長120bp。

1.2.5 HRM檢測 將PCR產(chǎn)物移入HRM專用96孔板內(nèi)，在Light Scanner TMHR－I 96上進行HRM分析:從45℃開始，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲線，到98℃結(jié)束，用Light Scanner Call IT軟件對采集后的曲線進行分析，判定基因型。

1.2.6 RFLP分型 PCR產(chǎn)物經(jīng)8%PAGE電泳后，凝膠成像觀察PCR擴增結(jié)果，符合要求后，用DdeⅠ酶進行酶切，時間控制在7～8小時。酶切完成后8%PAGE電泳，凝膠成像觀察分型結(jié)果。酶切體系共 10μl，其中包括:Buffer 1μl，DdeⅠ酶0.3μl，雙蒸水5.7μl和 PCR 產(chǎn)物3μl。

1.2.7 測序驗證 根據(jù)HRM分析的不同曲線及酶切結(jié)果確定不同的基因型。從所得的不同基因型的個體中分別隨機抽取5例樣本進行測序驗證。測序樣本重新進行PCR擴增，測序用PCR引物與PCR反應(yīng)所用引物相同。PCR反應(yīng)體系 50μl，包含:DNA 模板 5μl，10 × PCR Buffer 5μl，10 mmol/L dNTP 1μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl，去離子水補充總體積至50 μl。PCR反應(yīng)條件與第一次PCR條件相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察合格后送華大基因測序部進行測序驗證。

1.3 統(tǒng)計學方法 運用Hardy－Weinberg平衡檢驗研究樣本的群體代表性。用比數(shù)比(OR)值及其95%可信區(qū)間(95%CI)來評價相對風險。組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異顯著性標準。

2.結(jié)果

2.1 STAT4基因分型結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)HRM分析后，可根據(jù)樣本的熔解曲線差異，將所有樣本分為3個組。3組之間的熔解曲線差異非常明顯，見圖1。測序結(jié)果進行網(wǎng)上BLAST比對，序列完全一致。rs10181656PCR產(chǎn)物經(jīng)DedⅠ酶切后，GG型為兩個條帶，分別長66bp和35bp;GC型為三個條帶，分別長 101bp、66bp和 35bp;CC型為一個條帶，長101bp，見圖2。HRM及RFLP分型結(jié)果與測序的結(jié)果完全吻合，準確率為100%，測序圖見圖2。

2.2 STAT4基因型和等位基因頻率在病例組及正常對照中的分布 用SPSS 16.0軟件對STAT4基因上4個SNP位點rs7574865、rs8179673、rs10181656及rs7582694在病例和對照中基因型和等位基因頻率分布進行分析后，發(fā)現(xiàn)無顯著性差異(P ＞0.05)，見表1。

2.3 STAT4基因單倍型頻率和風險分析 用SHEsis在線軟件將這4個SNPs組成的單倍型進行頻率和風險分析后，結(jié)果只有rs8179673和rs10181656組成的單倍型TG在病例和對照中分布具有顯著性差異(P=0.045;OR=3.126，95%CI:0.973～10.044)，見表2。

表1 吉林人群中STAT4基因型和等位基因頻率分布比較

表2 STAT4基因單倍型頻率和風險分析

續(xù)表2

3.討論

STAT4基因定位于2q32.2－32.3，全長121kb，含24個外顯子，編碼序列(CDS)區(qū)由2247個連續(xù)核苷酸組成，編成748個氨基酸。STAT4具有STAT家族其他成員相似的蛋白結(jié)構(gòu)，均由C端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，近C端的Src同源結(jié)構(gòu)域及所有STAT共有的701氨基酸上的酪氨酸位點，中部的DNA結(jié)合域及N端保守區(qū)等幾部分構(gòu)成。但STAT4的表達譜不及其他STAT蛋白廣泛，主要分布在淋巴和髓系組織中。STAT4主要由 IL －12 激活，但也可被 IFN － α/β，IL －23 激活［5，6］。IL－12與受體(IL－12R)特異性結(jié)合，IL－12R發(fā)生二聚化，激活JAK，繼而受體信號轉(zhuǎn)導鏈特定區(qū)域酪氨酸位點磷酸化，招募STAT4單體，JAK對STAT4單體產(chǎn)生激活作用?；罨蟮腟TAT4形成同源二聚體，并穿越核膜識別DNA上的特定靶序列，啟動特異的基因轉(zhuǎn)錄，從而增加IFN－γ的產(chǎn)生［7］。

Zervou等發(fā)現(xiàn)rs7574865突變等位基因T，一個之前曾報道與許多自身免疫性疾病有關(guān)的等位基因，在銀屑病患者中要比在對照中更普遍，因此推論rs7574865多態(tài)性與希臘銀屑病的發(fā)生有關(guān)［8］。Ji JD等進行的 meta分析說明rs7574865與類風濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡顯著關(guān)聯(lián)［9］。另外許多研究已報道STAT4是與類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及Ⅰ型糖尿病關(guān)聯(lián)的易感基因［10～13］。

為探討STAT4這4個SNPs與吉林人群AS發(fā)生的關(guān)系，我們采用病例 －對照設(shè)計，應(yīng)用 PCR－HRM技術(shù)檢測rs7574865、rs8179673和 rs7582694，用 PCR －RFLP技術(shù)檢測了rs10181656多態(tài)性在吉林AS病例組與正常對照組之間的分布情況。在本研究中，我們對病例組和正常對照組的基因型頻率進行了Hardy－Weinberg平衡檢驗(P＞0.05)，表明我們所選擇的群體具有很好的代表性。我們用基因片段測序技術(shù)對PCR－HRM和PCR－RFLP技術(shù)進行驗證和質(zhì)量控制，準確率100%，基因分型結(jié)果穩(wěn)定可靠。

本研究結(jié)果顯示，rs7574865、rs8179673、rs7582694和rs10181656位點的各種基因型頻率及各等位基因頻率在吉林AS病例組與正常對照組之間的分布均無顯著性差異(P＞0.05)。本研究結(jié)果表明 rs7574865、rs8179673、rs7582694和rs10181656可能與吉林人群AS的發(fā)生無關(guān)聯(lián)。但經(jīng)多位點單倍型頻率分布分析后發(fā)現(xiàn)，rs8179673和rs10181656位點組成的單倍型TG在病例和對照中分布具有顯著性差異(P=0.045;OR=3.126，95%CI:0.973 －10.044)。因此，我們可以推斷在rs8179673和rs10181656之間的連鎖區(qū)域內(nèi)或其周圍序列中可能存在與AS真正關(guān)聯(lián)的變異。

限于本研究所涉及的樣本數(shù)量有限，本次研究未發(fā)現(xiàn)STAT4基因與吉林人群AS發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)性，但本研究結(jié)果尚不能確定STAT4基因與吉林人群AS發(fā)生之間的確切關(guān)系。

對于STAT4基因與吉林人群AS發(fā)生相關(guān)性的最終結(jié)論，還需在其他群體及更大樣本中進一步探索，以便為AS的病因?qū)W研究、診斷及治療提供理論依據(jù)。

附圖

圖1 HRM分析rs7582694，灰色為GC型，紅色為GG型，為CC型

圖2 rs10181656 位點 PCR 產(chǎn)物酶切電泳圖，1、3、5、7、8、9、10、11為 GC 型(101bp、66bp和35bp)，12為 GG 型(66bp和35bp)，2、4、6為 CC 型(101bp)

1 Laval S H，Timms A，Edwards S，Bradbury L，Brophy S，Milicic A，Rubin L，Siminovitch K A，Week D E，Calin A，Wordsworth B P，Brown M A.Whole-genome screening in ankylosing spondylitis:evidence of non-MHC genetic-susceptibility loci［J］.Am J Hum Genet，2001，68(4):918－926.

2 Finnegan A，Grusby MJ，Kaplan CD，et al.IL －4 and IL －12 regulate proteoglycan-induced arthritis through Stat-dependent mechanisms［J］.J Immunol，2002，169(6):3345 －3352.

3 Yang Z，Chen M，Ellett JD，et al.Autoimmune diabetes is blocked in Stat4-deficient mice［J］.J Autoimmun，2004，22(3):191 －200.

4 Goie The H S，Steven M M，van der Linden S M，Cats A，Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis:A comparison of the rome，new york and modified new york criteria in patients with a positive clinical history screening test for ankylosing spondylitis［J］.Br J Rheumatol，1985，24(3):242 －249

5 Nguyen KB，Wafford WT，Salomon R，et al.Critical role for STAT4 activation by typeⅠinterferons in the interferon-gamma response to viral infection［J］.Science，2002，297(5589):2063 －2066.

6 Watford WT，Hissong BD，Bream JH，et al.Signaling by IL －12 and IL－ 23 and the immunoregulatory roles of STAT4［J］.Immunol Rev，2004，202(2):139 －156.

7 Wafford WT，Morignehi M，Morinobu A，et al.The biology of IL －12:coordinating innate and adaptive immune responses［J］.Cytokine ＆Growth Factor Rev，2003，14(5):316 －368.

8 Zervou MI，Goulielmos GN，Castro-Giner F et al.STAT4 gene polymorphism is associated with psoriasis in the genetically homogeneous population of Crete，Greece［J］.Hum Immunol.70(9):738 －741.

9 Ji JD，Lee WJ，Kong KA et al.Association of STAT4 polymorphism with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus:a meta-analysis［J］.Mol Biol Rep.2010，37(1):141 －7.

10 Liang YL，Wu H，Li PQ et al.Signal transducer and activator of transcription 4 gene polymorphisms associated with rheumatoid arthritis in Northwestern Chinese Han population［J］.Life Sci，2011，1，89(5 －6):171－5.

11 SU Yin，ZHAO Yi，LIU Xu 等.Variation in STAT4 is associated with systemic lupus erythematosus in Chinese Northern Han population［J］.中華醫(yī)學雜志(英文版)，2010，123(22):3173 －3177.

12 李萍，欒海霞，胡朝軍等.IRF7/KIAA154和STAT4基因多態(tài)性與中國漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2010，33(7):611 －617.

13 Zervou MI，Mamoulakis D，Panierakis C et al.STAT4:a risk factor for type1 diabetes?［J］Human Immunology，2008，69(10):647 －650.