霍仕霞， 彭曉明， 高 莉， 周 露， 斯拉甫·艾白

(新疆維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊830049)

中藥血清藥化是以血液中的有效成分為研究對(duì)象，采用現(xiàn)代分析方法鑒定口服中藥后血清中藥源性成分及移行成分，它能夠直觀地分析中藥口服后的血液中的形態(tài)表現(xiàn)，快速尋找藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。沒食子Galla Turcica是新疆維吾爾醫(yī)常用藥，它是沒食子蜂科昆蟲沒食子蜂Cynips gallae-tinctorice Oliv．的幼蟲，寄生于殼斗科植物沒食子樹Quercus infectoria Oliv．幼枝上，所產(chǎn)成的蟲癭。沒食子富含鞣質(zhì)，約占50% ～70%，其次為沒食子酸、丙酸、樹脂等。其中沒食子鞣質(zhì)具有收斂、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗免疫、抗病毒、降血脂、降血糖［1-2］等作用。而沒食子鞣質(zhì)是在體內(nèi)以何種形式發(fā)揮作用，至今尚未見有報(bào)道，本研究在建立沒食子高效液相色譜指紋圖譜的同時(shí)，應(yīng)用血清藥物化學(xué)方法，分析比較沒食子粉末與提取物含藥血清指紋圖譜，快速分析和篩選沒食子活性成分，研究其可能的作用物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

高效液相色譜儀:Waters1525二元泵高效液相色譜儀，Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器，Waters2996紫外檢測(cè)器，Empower數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(美國);TGL-16B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造);SGT7200HBT型超聲清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司);Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(18 MΩ，Millipore公司);BS110S電子天平(北京賽多利斯有限公司)。

1．2 試藥

沒食子購于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)鑒定為沒食子蜂科昆蟲沒食子蜂Cynips gallaetinctoriae Olivier的幼蟲寄生于沒食子樹上的蟲癭。沒食子酸對(duì)照品(批號(hào):110831-200803)購于中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純;磷酸(優(yōu)級(jí)純，天津市化學(xué)試劑三廠);普通氮?dú)?≥99%，新疆康迪實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)。

1．3 動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠，6～8周齡，質(zhì)量(200±20)g，雄性，由新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào):SYXK(新)2003-0003。每組各5只。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件［3］

通過對(duì)比選擇不同檢測(cè)波長、柱溫、不同流動(dòng)相和洗脫方法，對(duì)供試品溶液進(jìn)行HPLC分析，對(duì)所獲取的供試品色譜圖中所呈現(xiàn)色譜峰的個(gè)數(shù)、分離度、峰對(duì)稱性、峰面積等參數(shù)進(jìn)行比較和分析，最終確定色譜條件為:Waters symmetry ShieldTMRP18色譜柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0．2%磷酸水溶液;檢測(cè)時(shí)間50 min;柱溫30℃;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣量20μL;檢測(cè)波長270 nm;梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Tab．1 Gradient elution program

2．2 供試品溶液的制備［4］

2．2．1 沒食子供試液的制備 取沒食子粉末(過40目篩)5 g，加入水溶液50 mL，超聲提取兩次，料液比1∶10，時(shí)間60 min和30 min，過濾，合并濾液，再用雙蒸水定容到250 mL棕色量瓶中(母液C=10 mg/mL)，溶液過0．45μm微孔濾膜，取濾液20μL進(jìn)行HPLC分析。

2．2．2 沒食子灌胃液的制備

(1)沒食子粉末灌胃液制備 沒食子藥材常規(guī)粉碎，過100目篩，用CMC-Na制備成混懸液，濃度為40%，備用。

(2)沒食子超微粉灌胃液制備 沒食子藥材經(jīng)常規(guī)粉碎后，進(jìn)一步超微粉碎，經(jīng)檢測(cè)，平均粒徑75 μm以內(nèi)，用CMC-Na制備成混懸液，濃度為40%，備用。

(3)沒食子提取物 沒食子藥材粉碎成粗粉(過40目篩)，水溶液回流提取兩次，每次1 h，合并濾液，70℃濃縮，55℃真空干燥，粉碎成細(xì)粉，用CMC-Na制備成混懸液，濃度為24%(按出膏率折算等效劑量)，備用。

2．3 對(duì)照品溶液的制備

取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含3μg的溶液，即得。

2．4 血清樣品的采集和處理［5-6］

2．4．1 給藥與采血 Wistar大鼠隨機(jī)分為給藥組和空白組，每組5只，禁食12 h(自由飲水)，給藥組以藥液量20 mL/kg灌胃，空白組給予同體積的蒸餾水，每日2次，連續(xù)3 d。末次給藥后1．5 h，乙醚麻醉，大鼠腹主動(dòng)脈采血，低速離心，分離血清，置－20℃冰箱中冷凍備用。

2．4．2 血清樣品的處理 取空白及給藥組血清各2 mL，加10 mL甲醇，搖勻后，微量振蕩器振蕩5 min，放置4～5 h，自然沉淀蛋白，吸取上清液，置10 mL試管中，用氮?dú)鉂饪s約0．5 mL，用甲醇沖洗全部轉(zhuǎn)移至1．5 mL EP管中，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?．2 mL甲醇溶解(若渾濁可10 000 r/min離心處理)，上清液過0．45μm濾膜，取20μL經(jīng)HPLC分析。

2．5 高效液相色譜分析

按2．1項(xiàng)下液相色譜條件，分別測(cè)定沒食子供試液、沒食子常規(guī)粉末含藥血清、沒食子超微粉含藥血清、沒食子提取物含藥血清和空白血清的高效液相色譜指紋圖譜(見圖1)。本課題組前期研究［7］建立了沒食子藥材指紋圖譜，標(biāo)定了7個(gè)共有峰，故本研究以這7個(gè)共有峰為研究入血的主要考察峰。通過比較沒食子含藥血清與空白血清色譜峰，3種含藥血清均出現(xiàn)了3個(gè)相同的新色譜峰，即1，a，5號(hào)峰，超微粉含藥血清中出現(xiàn)1個(gè)不同的新色譜峰，即3號(hào)峰，結(jié)果見圖1(B，C，D)。與沒食子供試液的指紋圖譜比對(duì)，1，3，4，5號(hào)峰分別一一對(duì)應(yīng)，表明沒食子中有4個(gè)成分以原型的形式吸收入血。而峰a是沒食子含藥血清的特有峰，原因可能是沒食子經(jīng)大鼠口服后在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。研究中采用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行色譜峰比對(duì)，發(fā)現(xiàn)1號(hào)峰的保留時(shí)間與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間吻合，由此可知，給予大鼠沒食子后，血液中的確有沒食子酸的存在;而在沒食子含藥血清色譜圖中b號(hào)峰位置，沒食子供試液和空白血清在相近位置上都出現(xiàn)此峰，該色譜峰僅是血清中的固有成分，還是血清固有成分與沒食子原型成分的疊加，有待采用質(zhì)譜及核磁共振波譜等檢測(cè)方法做進(jìn)一步考察［8-11］。

A．沒食子供試品 B．沒食子常規(guī)粉末含藥血清 C．沒食子超微粉含藥血清 D．沒食子提取物含藥血清 E．空白血清A．sample B．conventional powder containing serum C．serum containing ultrafine D．extracts containing serum E．blank serum

3 討論

本研究在分析沒食子供試品和血清樣品時(shí)，均采用了完全相同的色譜條件，因此，建立的沒食子供試品HPLC指紋圖譜與含藥血清的HPLC指紋圖譜中的色譜峰能夠滿足一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，同時(shí)進(jìn)行了方法學(xué)考察，均滿足分析檢測(cè)的要求。在處理血清樣品時(shí)，考察了有機(jī)試劑沉淀法、熱水浴法，考慮處理方法對(duì)色譜峰的干擾影響，最終確定采用甲醇沉淀法處理血清樣品，用氮?dú)獾蜏貪饪s法富集血中的成分，以便獲得更多的信息。

本研究采用血清藥物化學(xué)的方法對(duì)維藥沒食子進(jìn)行研究;通過比較沒食子水提取物、沒食子常規(guī)粉末、超微粉、提取物含藥血清和空白血清HPLC指紋圖譜的差異，確定5個(gè)血中移行成分，其中4個(gè)為原型成分，1個(gè)可能為原型成分的代謝產(chǎn)物，4個(gè)入血成分可能為沒食子的體內(nèi)直接作用物質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行深入的研究，將有助于闡明沒食子藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥效機(jī)制。在測(cè)定沒食子粉末、超微粉、提取物中的鞣質(zhì)及水解前后的沒食子酸時(shí)，發(fā)現(xiàn)沒食子中的主要成分以沒食子鞣質(zhì)為主，且鞣質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于50%，水解前沒食子酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為2%左右，水解后沒食子鞣質(zhì)降解為沒食子酸存在，故在本次研究中發(fā)現(xiàn)3種含藥血清中均含有沒食子酸峰，很有可能是沒食子鞣質(zhì)在大鼠體內(nèi)經(jīng)過胃腸道作用，在不同的pH環(huán)境下，降解為沒食子酸，吸收入血，這提示沒食子的作用物質(zhì)有可能是沒食子鞣質(zhì)在體內(nèi)降解后的沒食子酸。

沒食子超微粉含藥血清中的3號(hào)峰與供試液有對(duì)應(yīng)關(guān)系，而其他兩種含藥血清均無對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明3號(hào)峰所對(duì)應(yīng)的成分經(jīng)超微粉碎后，在實(shí)現(xiàn)藥材細(xì)胞級(jí)破壁微粉碎的同時(shí)，使其從細(xì)胞內(nèi)暴露出來，藥物的釋放速度及釋放量增加，大幅度提高了吸收的速度，故在血清指紋圖譜比較時(shí)，超微粉含藥血清色譜峰中的3號(hào)峰能夠與沒食子供試液吻合。而常規(guī)粉末和提取物的含藥血清的色譜峰中卻無此峰，沒食子提取物雖然經(jīng)過溶劑浸泡提取的過程，但該成分很可能在提取的過程中被破壞，均表明超微粉碎有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，更有利于藥物有效成分的在機(jī)體內(nèi)的吸收、利用，提高生物利用度［12-13］。提取物含藥血清中4號(hào)峰與供試液有對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明該峰所對(duì)應(yīng)的成分經(jīng)水溶液煎煮后，形成特定的狀態(tài)，更有利于大鼠吸收，優(yōu)于超微粉;可見，選擇合適的制備工藝，其有效成分是否能夠被機(jī)體吸收利用是最重要的。

通過血清藥化的研究方法初步研究沒食子的入血成分及代謝產(chǎn)物，為研究其作用物質(zhì)及有效成分的代謝吸收提供有力的證據(jù)。4個(gè)直接入血成分的性質(zhì)及藥理作用，后續(xù)研究將繼續(xù)從原藥材中制備、分離、純化入血成分，代謝產(chǎn)物及其前體化合物的推導(dǎo)，進(jìn)一步通過液質(zhì)聯(lián)用及液核聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行相關(guān)的考察，以期獲得更多的信息，為開發(fā)維藥沒食子提供技術(shù)支持。

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