李 燕， 晁 愚， 吳威巍， 楊 方， 莊昌龍， 吳 彤*

(1．上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海200040;2．上海方心健康科技發(fā)展有限公司，上海200032)

疏肝脂片源于臨床經(jīng)驗(yàn)方舒肝祛脂膠囊，由柴胡、三七、枳實(shí)、白術(shù)等九味中藥組成，具有疏肝消脂、清熱化積、行氣活血的功效，用于治療非酒精性單純性脂肪肝。為有效控制該制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)按照中藥六類新藥的注冊(cè)要求對(duì)該制劑進(jìn)行質(zhì)量研究。柚皮苷為枳實(shí)中的主要有效成分，具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化的生物學(xué)活性，能降低膽固醇、減少血栓的形成［1-3］，并且在該制劑中含有量較高，因此采用高效液相色譜法測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時(shí)對(duì)柴胡、三七、白術(shù)進(jìn)行定性鑒別。實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單可靠，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 HP1100高效液相色譜儀(G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1316A柱溫箱，G1314AVWD檢測(cè)器，美國(guó)HP公司);KQ2200超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);HHS電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械二廠);BP211D型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1．2 試藥 疏肝脂片(批號(hào)080625-1，080625-2，080625-3，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院自制);柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)110722-200610，供定量測(cè)定用);人參皂苷 Rg1(批號(hào) 110703-200424，供定量測(cè)定用);柴胡對(duì)照藥材(批號(hào) 120992-200504);白術(shù)對(duì)照藥材(批號(hào)120925-200407)，上述對(duì)照品及對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;柴胡皂苷C對(duì)照品(批號(hào)080314，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院自制，純度﹥98%);乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2．1 柴胡 取本品10片，研細(xì)，過(guò)75目篩，稱取粉末0．35 g，加甲醇10mL，超聲提取10min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL超聲使成懸濁液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，以水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取柴胡對(duì)照藥材0．1 g，加甲醇10mL，超聲處理10min，濾過(guò)，濾液濃縮至約1 mL，作為對(duì)照藥材溶液;取柴胡皂苷C對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0．5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺柴胡的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(2010版中國(guó)藥典一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水(10∶2∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，60℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 疏肝脂片中柴胡薄層色譜圖

2．2 三七 取本品10片，研細(xì)，過(guò)75目篩，稱取粉末0．35 g，加甲醇10mL，超聲提取10min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL超聲使成懸濁液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，以水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Rg1對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0．5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取缺三七的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(2010版中國(guó)藥典一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)10℃以下放置的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，晾干，噴以10%硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 疏肝脂片中三七的薄層色譜圖

2．3 白術(shù) 取本品10片，研細(xì)，過(guò)75目篩，稱取粉末1 g，加甲醇10 mL，超聲提取20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL超聲使成懸濁液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，以三氯甲烷提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘?jiān)?．5 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。另取白術(shù)對(duì)照藥材0．1 g，加甲醇10 mL，80℃水浴回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取缺白術(shù)的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照高效液相色譜法(2010版中國(guó)藥典一部附錄Ⅵ D)試驗(yàn)，以十八烷基鍵合硅膠為填充劑;乙腈-水(45∶55)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，體積流量1mL/min，柱溫25℃。吸取上述3種溶液各20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，供試品色譜中，應(yīng)呈現(xiàn)與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰，陰性對(duì)照無(wú)該色譜峰。結(jié)果見(jiàn)圖3。

3 定量測(cè)定

3．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;乙腈-水(20∶80)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm［4-7］，體積流量1 mL/min，柱溫25℃。理論板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。結(jié)果見(jiàn)圖4。

3．2 供試品溶液的制備 取本品10片，研細(xì)，過(guò)75目篩，取粉末約35 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇約9 mL，超聲提取20 min，放冷至室溫，再加50%甲醇至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3．2 供試品溶液的制備 取本品10片，研細(xì)，過(guò)75目篩，取粉末約35 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇約9 m L，超聲提取20 min，放冷至室溫，再加50%甲醇至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

圖3 白術(shù)定性鑒別的HPLC圖譜

圖4 柚皮苷定量測(cè)定的HPLC圖譜

3．5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取柚皮苷對(duì)照品溶液(0．337mg/mL)適量，以 50% 甲醇分別稀釋至 0．168、0．084 2、0．042 1、0．003 37 mg/mL，分別精密吸取上述溶液 20 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定，以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積進(jìn)行回歸，得回歸方程為 Y=3．72 ×104X-43．6，r=0．999(n=5)，表明柚皮苷進(jìn)樣量在0．067 4μg～6．74μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3．6 精密度試驗(yàn) 精密吸取質(zhì)量濃度為0．084 2 mg/m L的柚皮苷對(duì)照品溶液20μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，柚皮苷峰面積的RSD為0．22%(n=6)，表明儀器精密度良好。

3．7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，分別在0、2、4、8 h進(jìn)樣20μL，測(cè)定，柚皮苷面積RSD為2．2%，表明供試品溶液中柚皮苷在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3．8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的樣品6份，制備供試品溶液并測(cè)定，柚皮苷的RSD為0．96%，表明該試驗(yàn)方法的重復(fù)性較好。

3．9 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)的樣品6份，分別加入一定量的柚皮苷對(duì)照品，制備供試品溶液，精密吸取20μL注入液相色譜儀，測(cè)定柚皮苷，計(jì)算加樣回收率，柚皮苷回收率平均值為98．6%，RSD為2．2%，說(shuō)明該測(cè)定方法回收率較好，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3．10 樣品的測(cè)定 取3批片劑(批號(hào)080625-1，080625-2，080625-3;平均片質(zhì)量分別為 370．81 mg，370．67 mg，370．33 mg)，每批取2個(gè)樣品，制備供試品溶液，測(cè)定柚皮苷量，3批樣品中柚皮苷量分別為 8．64 mg/片、8．60 mg/片、9．18 mg/片。

4 討論

4．1 柴胡的鑒別方法參考2010版中國(guó)藥典［8］263，考察不同比例的展開(kāi)劑，包括乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)，乙酸乙酯-乙醇-水(8 ∶2 ∶1)展開(kāi)兩次，乙酸乙酯-乙醇-水(10 ∶2 ∶1)等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，后兩種展開(kāi)方法均有較好的展開(kāi)效果，但是乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)需要展開(kāi)兩次，所用時(shí)間較長(zhǎng)，因此，選擇乙酸乙酯-乙醇-水(10 ∶2 ∶1)。

4．2 三七的鑒別方法使用了多種展開(kāi)劑，包括正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1 ∶5)、三氯甲烷-甲醇-水(13 ∶7 ∶2)下層溶液［9］、三氯甲烷-甲醇-水(13 ∶6 ∶2)下層溶液、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶22 ∶10)下層溶液［8］11等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，3種展開(kāi)劑均有較好的分離效果，但是由于正丁醇-乙酸乙酯-水系統(tǒng)背景顏色較深，三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水系統(tǒng)不穩(wěn)定，因此選擇三氯甲烷-甲醇-水系統(tǒng)，其中三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)下層溶液展開(kāi)效果更好，故最終選擇三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)下層溶液作展開(kāi)劑。

4．3 實(shí)驗(yàn)中曾采用多種提取方法制備白術(shù)鑒別的供試品溶液，更換不同的展開(kāi)系統(tǒng)，均未找到合適的鑒別白術(shù)的薄層層析方法，因此，選擇用高效液相色譜法對(duì)白術(shù)進(jìn)行鑒別［10-11］。

4．4 實(shí)驗(yàn)中對(duì)柚皮苷的提取時(shí)間進(jìn)行考察，10 min、20 min、30 min柚皮苷的提取率分別為 2．89%、2．91%、2．92%，確定20 min可將柚皮苷提取完全，因此選擇超聲提取20 min。

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