顧海，房德房，杜偉蜂，蔡寶昌，詹瑧，王明艷

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210029;2.連云港中藥學(xué)校，江蘇連云港222006;3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053)

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)的干燥成熟果肉，其臨床常用的飲片有山萸肉、酒山萸肉。生品長(zhǎng)于斂汗固脫，用于自汗或大汗不止，陰虛盜汗;酒蒸后補(bǔ)益肝腎作用增強(qiáng)，多入滋補(bǔ)劑，常用于眩暈耳鳴，陽(yáng)痿遺精，遺尿尿頻，月經(jīng)過(guò)多或崩漏，腰部酸痛，大汗虛脫，內(nèi)熱消渴等癥。課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［1－6］:山茱萸及其提取部位對(duì)小鼠衰老模型及其它病理?yè)p傷模型有一定的影響，表現(xiàn)在對(duì)肝臟、腎臟的保護(hù)作用，能提高免疫功能等。本研究以離體肝細(xì)胞、腎細(xì)胞等為研究對(duì)象，制備化學(xué)損傷模型，觀察山茱萸不同提取部位在細(xì)胞層面的作用，以補(bǔ)充說(shuō)明整體實(shí)驗(yàn)，同時(shí)為進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)理探討打基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑

RPMI－1640培養(yǎng)粉(GIBCO，USA);小牛血清(杭州四季青);胰蛋白酶(Typrin，1:250，Amerso，USA);MTT(上海伯奧生物科技公司);二甲基亞砜(分析純，MERCK)。

1.2 細(xì)胞

人肝細(xì)胞L－02:南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院饋贈(zèng);大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY－1由武漢細(xì)胞生物研究所提供。

1.3 儀器

超凈工作臺(tái)，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試藥液制備

山茱萸水煎液的制備:分別取一定量的山茱萸生品、制品，用10倍量蒸餾水煎煮1h，趁熱抽濾，藥渣加10倍量蒸餾水煎煮1h，趁熱抽濾，合并濾液，60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。

取一定量水煎液加乙醇至濃度達(dá)80%，冰箱中靜置24h醇沉，抽濾得醇沉粗多糖部位和醇溶部位，醇沉粗多糖部位于50℃真空干燥至恒重，精密稱(chēng)定山茱萸多糖的重量備用;醇溶部位再依次用二氯甲烷、正丁醇萃取，余下為水部位。

山茱萸總提物的制備:分別取一定量的山茱萸生品、制品，用10倍量95%乙醇回流提取1.5h，趁熱抽濾，藥渣加10倍量50%乙醇回流提取1.5h，趁熱抽濾，藥渣加10倍量蒸餾水回流提取1.5h，趁熱抽濾，合并濾液，60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。

取山茱萸總提物，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，揮干溶劑即得相應(yīng)的溶劑萃取部位。

用溶劑二甲基亞砜將上述不同提取部位溶解后制成母液，根據(jù)各部位實(shí)際得率折算成生藥濃度，用0.22μm的微孔濾器過(guò)濾除菌，置－20℃?zhèn)溆?。臨用時(shí)根據(jù)生藥臨床用量，換算出離體細(xì)胞的用量，用單培稀釋母液(使作用于細(xì)胞的藥液終濃度相當(dāng)于0.278g生藥/L，且二甲基亞砜含量小于0.5%)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

幾種細(xì)胞株根據(jù)其對(duì)血清和pH的要求，配制RPMI 1640培養(yǎng)液，按常規(guī)方法培養(yǎng)，嚴(yán)格無(wú)菌操作。

2.3 造模方式 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，選擇不同的致?lián)p化合物，制備細(xì)胞損傷模型如表1。

表1 致?lián)p細(xì)胞模型

2.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分組情況如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)分組情況

2.5 形態(tài)學(xué)觀察

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入一定量的0.25%胰酶消化，用含一定量的新生牛血清的RPMI 1640全成分培養(yǎng)液配成懸液，用血球細(xì)胞板計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞，配成2×105個(gè)/mL懸液，加入6孔細(xì)胞板，培養(yǎng)后用無(wú)血清培養(yǎng)液處理細(xì)胞，按藥液與單培1∶10的比例加入藥液，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24h后倒置顯微鏡觀察。

2.6 MTT 檢測(cè)

同上，取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液(2×105個(gè)/mL)，加入96孔細(xì)胞板，培養(yǎng)后用無(wú)血清培養(yǎng)液處理細(xì)胞，按藥液與單培1∶10的比例加入藥液，每個(gè)劑量重復(fù)6～8孔，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24h后，加入50μl用PBS配成的1mg/mL MTT溶液，37℃溫育4h，使MTT還原為formazan，棄細(xì)胞上清，加入100μl DMSO使formazan溶解，混懸儀混勻后用酶標(biāo)儀在490nm處測(cè)定每孔光密度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 H2O2、CdCl2對(duì) L02、HSZY －1細(xì)胞生長(zhǎng)造成的影響 如圖1所示。

圖1 倒置顯微鏡照片

由圖1可見(jiàn)，H2O2、CdCl2分別對(duì) L02、HSZY －1細(xì)胞生長(zhǎng)有影響，表現(xiàn)在模型組細(xì)胞稀少，部分出現(xiàn)細(xì)胞變圓，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮的凋亡特征。山茱萸不同萃取部位表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)保護(hù)作用。

3.2 山茱萸不同萃取部位對(duì)幾種化學(xué)致?lián)p細(xì)胞保護(hù)作用的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如表3所示。

由表3可知，山茱萸生、制品提取部位對(duì)化學(xué)致?lián)p細(xì)胞表現(xiàn)出保護(hù)作用，有的對(duì)H2O2、CCl4所致肝細(xì)胞損傷有保護(hù)作用;有的對(duì)CdCl2所致腎細(xì)胞損傷有保護(hù)作用;其中山茱萸制品水煎液、山茱萸制品總提液、山茱萸制品水煎液正丁醇萃取部位、山茱萸制品總提液正丁醇萃取部位對(duì)幾種化學(xué)致?lián)p的肝、腎細(xì)胞模型均表現(xiàn)出保護(hù)作用，且制品其作用優(yōu)于生品，山茱萸制品總提液石油醚萃取部位對(duì)肝細(xì)胞保護(hù)作用明顯。

表3 山茱萸不同提取部位對(duì)幾種化學(xué)致?lián)p細(xì)胞保護(hù)作用(±s)

表3 山茱萸不同提取部位對(duì)幾種化學(xué)致?lián)p細(xì)胞保護(hù)作用(±s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

OD值(×10－1)組別 L02(H2O2) L02(CCl4) HSZY－1(CdCl2)模型組1.28 ±0.06 1.44 ±0.23 1.54 ±0.10細(xì)胞對(duì)照組 2.27±0.05＊＊ 3.49±0.15＊＊ 1.87±0.5*用藥組1 1.17 ±0.40 2.06 ±0.21* 2.46 ±0.12＊＊用藥組2 1.68 ±0.18* 2.13 ±0.23* 2.25 ±0.17*用藥組3 1.73 ±0.07＊＊ 1.90 ±0.55 1.96 ±0.03＊＊用藥組4 1.52 ±0.01* 1.82 ±0.17* 2.25 ±0.50用藥組5 1.40 ±0.03 1.77 ±0.26 2.46 ±0.94用藥組6 1.85 ±0.28 1.94 ±0.25* 2.05 ±0.23*用藥組7 2.18 ±0.98 1.64 ±0.19 1.85 ±0.10＊＊用藥組8 1.53 ±0.28 1.67 ±0.11 2.00 ±0.03＊＊用藥組9 1.92 ±0.33 1.75 ±0.11* 2.21 ±0.05*用藥組10 1.79 ±0.13* 2.03 ±0.11＊＊ 2.01 ±0.06＊＊用藥組11 1.75 ±0.05＊＊ 2.47 ±1.02 2.12 ±0.14＊＊用藥組12 1.92 ±0.30 2.07 ±1.15 2.62 ±1.18用藥組13 2.17 ±1.00 1.65 ±0.11 1.90 ±0.11*用藥組14 1.90 ±0.14＊＊ 1.91 ±0.13* 1.87 ±0.06＊＊用藥組15 1.70 ±0.21 1.68 ±0.11 1.92 ±0.02＊＊用藥組16 1.69 ±0.11＊＊ 1.53 ±0.08 1.91 ±0.11＊＊用藥組17 1.73 ±0.13* 1.83 ±0.17* 2.16 ±0.22*用藥組18 1.67 ±0.12* 2.14 ±0.12＊＊ 2.20 ±0.02＊＊用藥組19 1.81 ±0.16* 1.85 ±0.26 2.15 ±0.17*用藥組20 1.79 ±0.17* 1.69 ±0.19 2.02 ±0.07＊＊用藥組21 1.23 ±0.05 1.47 ±0.03 1.90 ±0.09＊＊用藥組22 1.26 ±0.05 1.41 ±3.00 1.78 ±0.26用藥組23 1.22 ±0.03 1.45 ±0.11 2.00 ±0.27用藥組24 1.30 ±0.09 1.34 ±0.14 1.77 ±0.08*

前期藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:山茱萸生、制品及其提取部位具有保肝腎、增強(qiáng)免疫的功能，其中制品的作用優(yōu)于生品［2］。山茱萸正丁醇、石油醚萃取部位有補(bǔ)肝腎作用，且制品作用優(yōu)于生品，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，山茱萸生、制品及多種提取部位對(duì)化學(xué)致?lián)p肝、腎細(xì)胞有直接保護(hù)作用，其中山茱萸制品水煎液、山茱萸制品總提液、山茱萸制品總提液正丁醇萃取部位、山茱萸制品水煎液去多糖正丁醇萃取部位及山茱萸制品總提液石油醚萃取部位作用明顯，該結(jié)果驗(yàn)證了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說(shuō)明:山茱萸及其提取部位補(bǔ)肝腎作用包括細(xì)胞層面的直接保護(hù)作用，該研究為以細(xì)胞損傷模型作為研究對(duì)象，進(jìn)一步提取分離活性成分打下基礎(chǔ)。

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