于純淼，劉曉艷，張麗影，孟丹，國立東，于棟華

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150030;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040)

天然綠色植物色素安全無毒，并且具有特有的營養(yǎng)價(jià)值和生理活性。丹參紅色素作為一種天然色素，是從傳統(tǒng)中藥丹參中提取出來的脂溶性有效成分，為黃至深紅色混合物質(zhì)［1］。丹參紅色素包括丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮、二氫丹參酮等，均含有鄰醌或?qū)︴慕Y(jié)構(gòu)［2］，在生物體內(nèi)參與電子傳遞、機(jī)體的多種生物化學(xué)反應(yīng)，對(duì)某些生化反應(yīng)起促進(jìn)或干擾作用，表現(xiàn)出抗癌［3］、抗菌［4］、抗病毒等多種藥理作用。其中丹參酮ⅡA具有天然抗氧化作用，臨床心血管藥理作用表現(xiàn)在抗動(dòng)脈粥樣硬化、縮小心肌梗死面積、降低心肌耗氧量，對(duì)血栓形成以及血小板聚集功能有抑制作用，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷、誘導(dǎo)分化和凋亡作用，并調(diào)節(jié)多種腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)［5］。胃癌是我國常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率、死亡率在各種惡性腫瘤中居首位。丹參紅色素對(duì)人胃癌細(xì)胞作用的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。我們?cè)谘芯康⒓t色素金屬離子穩(wěn)定性的同時(shí)，以人胃癌細(xì)胞株SGC7901為觀察對(duì)象，研究丹參紅色素體外對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901的抑制作用，以探討丹參紅色素的金屬離子穩(wěn)定性及其對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丹參根莖(購于寶豐醫(yī)藥有限公司);丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品由中國藥品生物制品檢定所提供;蒸餾水;無水乙醇、乙酸乙酯均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

萬能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司);RE－52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海博通儀器設(shè)備有限公司);SHZ－3循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠);AL－104型精密電子天平(上海梅特勒－托利多儀器設(shè)備有限公司);KQ－500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UVmini－1240紫外可見分光光度計(jì)(日本島津);1640培養(yǎng)液(美國Hyclone);DMSO(天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司);IMT－413倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS IMT－413);細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Becton Dickinson);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國BIO－RAD)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色素試樣制備［6］

丹參→干燥→粉碎→溶劑提取→抽濾→濾液→減壓濃縮→浸膏→溶劑萃取→脂層→回收溶劑→重結(jié)晶→色素成品。

1.3.2 色素紫外可見吸收光譜及最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

將色素試樣配制成一定濃度的乙醇溶液，在300～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，以確認(rèn)丹參紅色素的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.3 丹參紅色素的金屬離子穩(wěn)定性研究［5，7］

精確稱取一定質(zhì)量的丹參色素成品溶于50%乙醇中，配成一定濃度的色素溶液備用。按1∶3的比例將配制好的不同濃度的 Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+及Fe3+溶液加入備用色素溶液中，隔2天于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。其中 Na+、K+離子濃度為0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L 及0.2mol/L;Mg2+濃度為 0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L;Ca2+濃度為1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L;Fe3+的濃度為 0.05mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L;Cu2+濃度為1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L。

1.3.4 丹參紅色素的抑癌性研究

采用四唑鹽(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)［8－9］:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔補(bǔ)足RP－MI1640培養(yǎng)液至180μl。37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后換新培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)孔依次加入不同濃度丹參紅色素藥液各 20μl，藥物終濃度分別為 5、10、15、20μg/ml;對(duì)照孔中無水乙醇終濃度為2%;實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別檢測(cè)丹參紅色素作用48h后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。于培養(yǎng)結(jié)束前4h，各培養(yǎng)孔加入10μl MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔內(nèi)加入150μl DMSO，振蕩15min使結(jié)晶充分溶解［8］。于酶標(biāo)儀上讀取各孔光吸收值(A)，測(cè)量波長(zhǎng)λ=492nm，參考波長(zhǎng) λ=620nm，按下式計(jì)算抑制率。

抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)孔A均值/對(duì)照孔A均值)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參紅色素最大吸收波長(zhǎng)的確定

將結(jié)晶純化后的丹參紅色素溶于無水乙醇中，配成一定濃度的丹參紅色素溶液，于紫外可見分光光度計(jì)上在300～700nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以確定丹參紅色素－乙醇溶液的最大吸收波長(zhǎng)。經(jīng)掃描，色素－乙醇溶液的最大吸收波長(zhǎng)為450nm。

2.2 Na+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響

不同濃度Na+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性影響結(jié)果如圖1所示。圖1表明，添加了Na+的色素溶液放置18天之內(nèi)，與對(duì)照CK相比，Na+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性影響不大。當(dāng)色素溶液中Na+的濃度低于0.15mol/L時(shí)，色素溶液的吸光值低于對(duì)照CK，但隨著色素溶液中的的濃度由0.05mol/L增加到0.15mol/L時(shí)，色素吸光值有所增加;當(dāng)色素溶液中Na+的濃度大于0.15mol/L時(shí)，色素的吸光值大于對(duì)照CK。由此可見，較高濃度的Na+對(duì)丹參紅色素具有一定的護(hù)色作用，而低濃度的Na+對(duì)丹參紅色素有一定的不良影響，原因有待進(jìn)一步研究。

圖1 不同濃度Na+對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effects of Na+on the stability of the Salvia red pigment

2.3 K+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響

不同濃度K+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響如圖2所示。由圖2可以看出，添加K+的色素溶液從開始即明顯高于對(duì)照CK。在放置18天之內(nèi)，添加K+的丹參紅色素溶液吸光度變化趨勢(shì)與對(duì)照CK相似，且隨著溶液中K+濃度的升高，色素溶液的吸光值就越大。由此可見，K+對(duì)丹參紅色素具有一定的增色作用，且K+濃度越高，增色作用越明顯。

圖2 不同濃度的K+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of K+on the stability of the Salvia red pigment

2.4 Mg2+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響

不同濃度Mg2+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響如圖3所示。由圖3可以看出，剛加入Mg2+時(shí)，色素的吸光值明顯增大。隨著Mg2+濃度的增加，色素吸光值增加幅度也增大，但當(dāng)濃度超過0.10mol/L時(shí)，色素溶液的吸光值又有所降低。從圖3還可以看出，添加Mg2+的丹參紅色素溶液在放置18天之內(nèi)，吸光值明顯大于對(duì)照CK。在0～12天時(shí)，對(duì)照CK和添加了Mg2+的色素溶液吸光值均呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，添加了Mg2+的色素溶液吸光值降幅大于CK;在12～18天時(shí)，色素溶液吸光值又有所增加，可能是由于丹參紅色素中的一些單體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化或相互發(fā)生了轉(zhuǎn)化［10］。

2.5 Ca2+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響

不同濃度Ca2+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響如圖4所示。由圖4可以看出，添加了Ca2+的丹參紅色素溶液在放置18天之內(nèi)，其吸光值明顯高于對(duì)照CK，這說明Ca2+對(duì)丹參紅色素具有一定的增色作用。在0～9天、12～18天，添加了Ca2+的丹參紅色素溶液其吸光值與CK呈現(xiàn)出了相反的變化趨勢(shì);9～12天時(shí)吸光值變化趨勢(shì)相似。

2.6 Fe3+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響

不同濃度Fe3+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響如圖5所示。剛開始向色素溶液中加入Fe3+后，色素溶液色澤發(fā)生了變化，且隨著Fe3+濃度的增加，色素顏色逐漸由櫻紅色變成黑褐色，當(dāng)濃度達(dá)到1mmol/L時(shí)，色素溶液還產(chǎn)生了黑色絮狀沉淀。由圖5可以看出，添加3種不同濃度的Fe3+－丹參紅色素溶液在放置18天之內(nèi)，其吸光度降幅均大于CK，且隨著Fe3+濃度的增加，色素溶液的吸光值越小。同時(shí)，隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，添加Fe3+的色素溶液的絮狀沉淀也逐漸增多。研究還發(fā)現(xiàn)，在0～6天，添加Fe3+的色素溶液吸光值下降，可能是由于Fe3+對(duì)色素的破壞作用;9～18天時(shí)色素溶液吸光值有所增加，可能是沉淀增加的原因。由此可見，F(xiàn)e3+對(duì)丹參紅色素有不良影響。

圖3 不同濃度的Mg2+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of Mg2+on the stability of the Salvia red pigment

圖4 不同濃度的Ca2+對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of Ca2+on the stability of the Salvia red pigment

圖5 不同濃度的Fe3+對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of Fe3+on the stability of the Salvia red pigment

2.7 Cu2+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響

不同濃度Cu2+對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性的影響如圖6所示。從圖6可以看出，當(dāng)向丹參紅色素溶液中加入Cu2+后，溶液吸光值在逐漸增大，且Cu2+濃度越大，溶液的吸光值也越大。但在研究中發(fā)現(xiàn)，色素溶液在儲(chǔ)藏12天后，添加了10mmol/L Cu2+的色素溶液開始產(chǎn)生少量黑色沉淀;當(dāng)色素溶液儲(chǔ)藏15天后，添加了5mmol/L Cu2+的色素溶液也開始出現(xiàn)少量黑色沉淀。由此可見，Cu2+對(duì)丹參紅色素有一定的不良影響。

圖6 不同濃度的Cu2+對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of Cu2+on the stability of the Salvia red pigment

圖7 MTT比色法測(cè)定在48h后不同濃度丹參紅色素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)Fig.7 Inhibitory effect on the growth of cells in vitro measured by MTT colorimetric assay at different concentrations of the Salvia red pigment after 48h

2.8 丹參紅色素對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖的影響［11－12］

不同濃度丹參紅色素對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞作用48h后的抑制效應(yīng)如圖7所示。從圖7可以看出，當(dāng)?shù)⒓t色素濃度為5mg/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞抑制率約為32.3%;當(dāng)?shù)⒓t色素濃度為15mg/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞的抑制率達(dá)到了51.3%，抑制率相對(duì)增加了60%。由此可見，丹參紅色素對(duì)SGC7901具有極強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用，且隨色素濃度的提高，對(duì)細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)20mg/L丹參紅色素處理SGC7901細(xì)胞48h后，對(duì)細(xì)胞增殖抑制率達(dá)52.17%，相對(duì)濃度為15mg/L處理的細(xì)胞增殖抑制率僅增加了約2%。這說明，當(dāng)?shù)⒓t色素濃度達(dá)到一定值時(shí)，隨色素濃度的提高，對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的增加并不明顯，因此我們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中以15mg/L為佳。此外，丹參紅色素對(duì)SGC7901的增殖作用具有劑量依賴性，但是否具有時(shí)間依賴性還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

通過對(duì)丹參紅色素金屬離子穩(wěn)定性和抑癌性研究結(jié)果表明:1)常見金屬離子對(duì)丹參紅色素穩(wěn)定性影響不大。其中，K+、Ca2+和Mg2+在所研究的濃度范圍內(nèi)具有較好的增色或護(hù)色作用;而對(duì)于Na+來說，當(dāng)Na+濃度在0.05～0.15mol/L范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)色素穩(wěn)定性影響不大;當(dāng)濃度達(dá)到0.2mol/L時(shí)，Na+對(duì)色素有增色作用。2)在所研究的濃度范圍內(nèi)，Cu2+雖也使色素溶液吸光值有所增加，但在儲(chǔ)藏一段時(shí)間后開始有黑色絮狀沉淀產(chǎn)生，這說明Cu2+對(duì)色素也具有一定的不良影響。3)當(dāng)Fe3+與色素溶液混合時(shí)，色素溶液由紅色變?yōu)楹稚?，且隨著溶液中Fe3+濃度的增大，溶液褐色加深并伴有黑色絮狀沉淀產(chǎn)生，由此可見，F(xiàn)e3+對(duì)色素具有較強(qiáng)的破壞作用。4)MTT結(jié)果顯示:5、10、15、20mg/L對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901具有生長(zhǎng)抑制作用，且呈現(xiàn)良好的劑量 －效應(yīng)關(guān)系;但丹參紅色素對(duì)SGC7901是否具有時(shí)間依賴性還有待進(jìn)一步研究。

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