楊志欣，孟永海，王秋紅，楊炳友，匡海學

(黑龍江中醫(yī)藥大學北藥基礎與應用研究省部共建教育部重點實驗室、黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥性味理論指導中醫(yī)臨床用藥幾千年，其成果極為豐厚。然而，由于其理論自身哲學氣息濃厚，內(nèi)容缺乏客觀、規(guī)范化的評價體系，導致性味理論對現(xiàn)代醫(yī)藥學的指導意義呈下降趨勢。因此，如何使深刻而豐富的性味理論得到科學的詮釋是我們面臨的迫切任務。遵循中醫(yī)藥學基本理論，本課題組提出了“中藥一味一性，一藥X味Y性(Y≤X)”的假說和基于中藥性味可拆分性和可組合性的研究思路，并構建了中藥性味理論研究的新模式［1－2］。吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸［Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.］、石虎［Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinaLis(Dode)Huang］或疏毛吳茱萸［Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang］的干燥近成熟果實。2010年版《中國藥典》收載吳茱萸:辛、苦，熱。為闡明吳茱萸辛味和苦味的物質(zhì)基礎，我們采用與吳茱萸性味功效相關的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗胃潰瘍、止嘔、止瀉等復合藥理學指標作為吳茱萸性味功效評價體系，對吳茱萸的各化學拆分組分的生物學效應進行了研究［3－5］。本文報道吳茱萸化學拆分組分的抗胃潰瘍作用結果。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar大白鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(190±10)g，合格證號為P00102007，由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心提供。

1.2 儀器與藥品

冰凍切片機(AT1720，日本立洋公司);光學顯微鏡(上海齊躍生物科技有限公司);吳茱萸購自哈爾濱市藥材公司(產(chǎn)地:貴州銅仁)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院中藥資源學教研室王振月教授鑒定為疏毛吳茱萸［Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var bod － inieri(Dode)Huang］的干燥近成熟果實;藥理實驗樣品(蒸餾水;吳茱萸水煎液;7個化學拆分組分，實驗室制備［3］);肝素鈉注射液(Heparin Sodium Injection，批號0507112，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司);乙醚等試劑均為分析純。

2 方法［6］

2.1 對應激型胃潰瘍的影響

Wistar大白鼠90只，雌雄各半，隨機分為9組，每組10只。分組為蒸餾水空白對照組、吳茱萸水煎液組、吳茱萸內(nèi)酯組、生物堿1組、生物堿2組、醇沉組、20%乙醇洗脫組、95%乙醇洗脫組和揮發(fā)油組。各組禁食12h后灌胃，按大鼠體重2ml/100g給藥，連續(xù)給藥4天。實驗前，將大鼠禁食48h，自由飲水。實驗時，給藥30min后，用乙醚輕麻大鼠，將動物仰臥固定于大鼠固定鋼板上，將其下半身置于(20±1)℃的冷水，水面齊劍突水平，5h后處死大鼠，打開腹腔，暴露胃。先結扎賁門，再由十二指腸經(jīng)幽門向胃內(nèi)注入1%甲醛固定液6mL(固定15min)，然后結扎幽門，剪下胃，浸泡于同一濃度的甲醛中20min。沿胃大彎剪開并展平，用小棉球輕輕將黏膜上的黏液和血塊擦掉，觀察黏膜損傷程度。石蠟包埋胃組織行4μm切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，光鏡下觀察黏膜組織學改變。

按Guth標準［7］計算潰瘍指數(shù)(UI):點狀出血為1分，線狀出血長度＜1mm為2分，1～2mm為3分，2～4mm為4分，＞4mm為5分，寬度＞1mm時分值×2。并按照下列公式計算胃潰瘍抑制率。

2.2 對幽門結扎胃潰瘍的影響

Wistar大鼠90只，雌雄各半，隨機分為9組，每組10只。分組同2.1。每天給予大鼠相應藥物，連續(xù)給藥4天，第4天各組給相應藥物后，禁食48h(禁食期間將動物置于底部升高的大孔金屬濾網(wǎng)的籠中，以防止其食糞和墊料;禁食期間不禁水)，末次給藥提前2h。48h后，將大鼠置于鐘罩內(nèi)，用乙醚麻醉后，固定在大鼠板上，自胸骨劍突下沿腹中線切開腹壁，切口約2～3cm，在左側肋緣部位，用指輕輕往上一推，使胃暴露于切口。在幽門下穿一線將幽門結扎(鄰近的其它血管不結扎)，結扎后各組大鼠均經(jīng)十二指腸注射藥液1次，潰瘍模型組注射同等容積的蒸餾水，然后縫合腹壁切口，用生理鹽水清洗，注射青霉素鈉5萬u/只。

縫合后，將動物單獨置于底部升高的大孔金屬濾網(wǎng)的飼養(yǎng)籠中，禁食水。經(jīng)18h后各組大鼠處死，結扎賁門，將胃取出，打開幽門或食道結扎端，收集胃液于刻度離心管中，以3 000rp/min速度離心20min。取上清胃液1mL，加酚紅指示劑1滴，用0.01mol/L NaOH滴定，直至胃液先呈黃色再轉(zhuǎn)為紅色2s內(nèi)不消失為終點，記錄用去的NaOH量，按照下列公式計算胃總酸度［8］。

總酸度(mmol/L)=耗去的NaOH量×10

按照改良Mett法測定胃液胃蛋白酶活性［9］:取內(nèi)徑為0.9～1.1mm的毛細玻璃管(10cm長)，洗凈烘干。取適量的雞蛋清，充分攪勻后用二層紗布過濾。將毛細玻璃管利用虹吸作用灌滿蛋清(內(nèi)無氣泡)后，置85℃恒溫水浴中使蛋清凝固，制成蛋白管。冷卻后，用石蠟將毛細管兩端封固，置冰箱中備用。取上述每只大鼠胃液上清液1mL，加入0.05mol/L鹽酸8mL搖勻。每瓶中放入長約5cm的蛋白毛細管2根，塞好瓶口，于37℃的恒溫箱放置24h后，取出毛細管，用游標卡尺測量毛細管兩端的透明長度，求平均值，計算胃蛋白酶活性，胃蛋白酶活性(kU/L)=平均值2×16。

潰瘍指數(shù)(UI)測定:由打開端注入10%甲醛溶液5mL，固定20min，沿胃大彎切開胃壁，清洗胃內(nèi)容物，展開胃壁，用小棉球輕輕將胃黏液及血凝塊擦掉，觀察胃黏膜損傷的程度和形態(tài)。按Guth標準［7］計算潰瘍指數(shù)(UI)，并計算胃潰瘍抑制率(同2.1)。

3 結果

3.1 對應激型胃潰瘍的影響

3.1.1 模型大鼠胃肉眼及光鏡觀察

冷水對大鼠應激刺激后，取大鼠胃肉眼觀察:大鼠胃底部黏膜大片瘀血、出血嚴重，潰瘍面較多;胃黏膜病理切片經(jīng)HE染色，光學顯微鏡觀察:胃黏膜上皮有缺損，胃底腺上皮細胞變性、壞死，黏膜層和黏膜下層偶見紅細胞及含鐵血黃素顆粒，黏膜下層偶見中性白細胞浸潤。

3.1.2 對應激型胃潰瘍的潰瘍指數(shù)影響

以潰瘍指數(shù)作為指標衡量作用效果，結果見表1。吳茱萸水煎液對應激型胃潰瘍的潰瘍指數(shù)與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。各化學拆分組分中揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分、醇沉組分與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。

3.1.3 給藥后模型大鼠胃肉眼及光鏡觀察

模型大鼠胃肉眼觀察，給予吳茱萸水煎液、揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分、醇沉組分后，大鼠胃黏膜出血明顯減少，且潰瘍部位面積縮小;其余各組對潰瘍改善不顯著。

表1 吳茱萸及各化學拆分組分對應激型胃潰瘍的潰瘍指數(shù)影響(±s，n=10)

表1 吳茱萸及各化學拆分組分對應激型胃潰瘍的潰瘍指數(shù)影響(±s，n=10)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量(g/kg)潰瘍指數(shù)(UI)抑制率(%)－ 35.6 ±11.1 －吳茱萸水煎液 1.35 11.0±3.2＊＊ 68.8揮發(fā)油組分 1.35 14.7±4.4＊＊ 58.7吳茱萸內(nèi)酯組分 1.35 22.4 ±7.0* 37.1生物堿1 組分 1.35 33.4 ±11.8 6.2 95%乙醇洗脫組分 1.35 28.9 ±8.6 18.8醇沉組分 1.35 17.3±5.8＊＊ 51.4生物堿2 組分 1.35 30.8 ±12.8 13.5 20% 乙醇洗脫組分空白對照1.35 31.0 ±10.0 12.9

模型大鼠胃黏膜病理切片經(jīng)HE染色，光學顯微鏡觀察:給予吳茱萸水煎液、揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分、醇沉組分，可見大鼠胃底腺上皮細胞基本完好，未見黏膜下層中性粒細胞浸潤等變化。其余各組具有不同程度的黏膜充血、糜爛及炎細胞浸潤。

3.2 對幽門結扎胃潰瘍的影響

對幽門結扎大鼠胃潰瘍的潰瘍指數(shù)、總酸度及胃蛋白酶活性等的作用結果見表2。結果表明，吳茱萸水煎液、揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分均能降低潰瘍指數(shù)，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05);其余各化學拆分組分與模型組比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。吳茱萸水煎液、揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分能降低大鼠胃液胃蛋白酶活性，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，對胃酸影響與模型組比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。實驗中還發(fā)現(xiàn)，生物堿2組分可降低胃酸度，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

表2 吳茱萸及各化學拆分組分對幽門結扎胃潰瘍的影響(±s，n=10)

表2 吳茱萸及各化學拆分組分對幽門結扎胃潰瘍的影響(±s，n=10)

注:與模型對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量(g/kg) 總酸度(mmol/L) 胃蛋白酶活性 潰瘍指數(shù)(UI) 抑制率(%)77.1 ±16.2 405.2 ±151.3 53.7 ±18.0 －吳茱萸水煎液 1.35 67.3 ±14.7 203.1 ±78.1＊＊ 32.6 ±14.0* 39.3揮發(fā)油組分 1.35 61.9±21.5 173.8±89.8＊＊ 29.0±5.0＊＊ 46.0吳茱萸內(nèi)酯組分 1.35 66.9 ±16.5 242.6 ±73.8* 38.8 ±11.0* 27.7生物堿1 組分 1.35 64.9 ±14.1 373.5 ±117.6 45.5 ±19.8 15.3 95%乙醇洗脫組分 1.35 71.4±14.3 425.3±142.6 66.2±21.5 －23.3醇沉組分 1.35 62.9 ±15.5 328.0 ±115.0 41.0 ±13.3 23.6生物堿 2 組分 1.35 58.7 ±14.1* 303.4 ±61.7 42.0 ±8.8 21.9 20%乙醇洗脫組分模型對照 －1.35 64.4 ±18.3 367.1 ±61.6 44.5 ±15.1 17.1

4 討論

關于實驗性胃潰瘍模型的選擇［6］，現(xiàn)代醫(yī)學證實胃潰瘍的發(fā)病機制與胃酸和胃蛋白酶的消化能力及胃黏膜屏障功能失調(diào)有關。精神情緒、應激狀態(tài)、藥物和飲食等則則引起胃潰瘍的誘因，據(jù)此學者們通過化學、物理以及應激等手段制備成功了許多胃潰瘍模型。

藥理實驗中常用的動物模型有:1)應激型胃潰瘍:用水或寒冷刺激，使皮層中樞的興奮及抑制過程失調(diào)，引起植物神經(jīng)調(diào)節(jié)紊亂而導致潰瘍形成。本法誘發(fā)潰瘍成功率高，方法簡便、穩(wěn)定，重復性好。2)幽門結扎型潰瘍:在麻醉無菌操作下結扎幽門，使胃液滯留胃中，胃壁防御機能減弱導致潰瘍形成。3)藥物誘發(fā)型潰瘍:消炎痛及阿斯匹林潰瘍模型—抑制胃黏膜環(huán)氧化酶，使前列腺素(對胃黏膜細胞有保護作用并能抑制胃酸分泌)合成減少，致胃黏膜細胞屏障機能減弱，胃酸增高而誘發(fā)潰瘍;組胺潰瘍模型—組胺可引起高酸度胃液大量分泌;利血平潰瘍模型—利血平可使兒茶酚胺耗竭，迷走神經(jīng)興奮性相對提高，使胃液分泌增多胃黏膜缺血而致潰瘍。4)醋酸損傷型潰瘍:用醋酸直接作用于胃壁組織而形成潰瘍。

前三種為急性潰瘍模型，通常在給予誘因后4～12h發(fā)生，因制備方法簡便，故應用較多。其中幽門結扎為Shay＇s傳統(tǒng)經(jīng)典大鼠胃潰瘍模型法;胃潰瘍疾病在中醫(yī)辨證中脾胃虛寒證居多，而對吳茱萸而言，其“性”偏熱，故其模型選擇上以通過“寒邪”應激引發(fā)較為適合，因此本研究選用了上述兩種實驗性胃潰瘍模型。

應激型胃潰瘍實驗中，揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分、醇沉組分表現(xiàn)出良好的治療作用;幽門結扎胃潰瘍實驗中，揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分同樣表現(xiàn)出治療作用。綜上，吳茱萸抗胃潰瘍物質(zhì)基礎為揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分、醇沉組分。

幽門結扎胃潰瘍實驗中，胃蛋白酶的測定結果提示吳茱萸水煎液、揮發(fā)油組分、吳茱萸內(nèi)酯組分抗胃潰瘍的機理與降低胃蛋白酶活性有關。生物堿2組分雖然對胃潰瘍沒有顯著治療作用，但可以顯著降低胃酸度，提示在胃潰瘍的治療中如果將其組合到其他組分中可能會有更好的協(xié)同治療作用。

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