金富銳，陳慧錚

(1.上海國際和平婦幼保健院，上海 200025;2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

下丘腦－垂體功能失調(diào)引起的繼發(fā)性閉經(jīng)是臨床常見的一種閉經(jīng)，其治療方式多采用雌、孕激素周期治療，但部分患者于停藥后仍呈現(xiàn)月經(jīng)異常。有研究認為，此時，采用中西藥聯(lián)合治療可提高治療效果［1］，減少停藥后的再次閉經(jīng)。本研究采用諾雷德建立中樞性閉經(jīng)動物模型，用中藥仙靈脾進行治療，為本類疾病治療提供一種有效的治療方法。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及給藥方法

性成熟而未生育、體質(zhì)量200g的雌性Wistar大鼠共40只，隨機分為4組:對照組、諾雷德組、仙靈脾組、雌激素組，每組各10只。

對照組:注射生理鹽水0.2ml;諾雷德組:注射諾雷德，0.2ml/只;仙靈脾組:注射諾雷德 0.2ml后，給予仙靈脾(0.2g/天)灌胃28天;雌激素組:注射諾雷德0.2ml后，給予苯甲酸雌二醇(0.072g/d)肌注28天。

第28天處死大鼠，取出卵巢組織，放入4%的多聚甲醛中，梯度酒精脫水后石蠟包埋，放入4℃冰箱待測。冰凍切片與雜交前預處理，雜交及雜交信號檢測參照試劑盒操作。

1.2 藥物及試劑

諾雷德(英國阿斯利康制藥公司);仙靈脾(天江中藥);苯甲酸雌二醇(上海信誼制藥);原位雜交試劑盒(北京源德生物醫(yī)學工程有限公司)。

1.3 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)采用F檢驗。

2 實驗結(jié)果

測定指標為陽性目標面密度，各組結(jié)果如下。

2.1 雌、孕激素受體水平的變化 見表1。

表1 雌、孕激素受體水平的變化(±s)

表1 雌、孕激素受體水平的變化(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與諾雷得組比較，△P ＜0.05。

卵巢雌激素受體 卵巢孕激素受體對照組0.166 ±0.036 0.211 ±0.009諾雷德組 0.108 ±0.012* 0.130 ±0.015*雌激素組 0.159±0.032△ 0.145±0.038仙靈脾組 0.162±0.052△ 0.198±0.021△

如表1所示，諾雷德組卵巢雌、孕激素受體水平較對照組均有下降(P＜0.05);雌激素組和仙靈脾組卵巢雌激素受體均較諾雷德組有顯著增高(P＜0.05);仙靈脾組卵巢組織孕激素受體較諾雷德組有顯著增加(P＜0.05)，雌激素組卵巢孕激素受體較諾雷德組有增高趨勢，但沒有統(tǒng)計學意義。

2.2 Fas和Bcl－2表達變化 見表2。

表2 Fas和Bcl－2表達變化(±s)

表2 Fas和Bcl－2表達變化(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與諾雷得組比較，△P ＜0.05。

Fas Bcl－2對照組0.022 ±0.006 0.171 ±0.025諾雷德組 0.033 ±0.002 0.105 ±0.010*雌激素組 0.028 ±0.010 0.129 ±0.033仙靈脾組 0.025±0.009△ 0.153±0.026△

如表2所示，諾雷德組中Fas表達顯著高于對照組;仙靈脾組Fas表達較諾雷德組有顯著降低(P＜0.05)，雌激素組則沒有顯著變化。諾雷德組Bcl－2表達顯著低于對照組，仙靈脾組處理后則顯著高于諾雷德組(P＜0.05)，而雌激素組無明顯變化。

3 討論

3.1 動物模型的成功建立

諾雷德是一種注射用的促黃體生成素釋放激素類似物，通過負反饋作用下丘腦，抑制下丘腦產(chǎn)生促性腺激素釋放激素;同時還能競爭性地與垂體細胞膜上的促性腺激素釋放激素受體或促黃體激素釋放激素受體結(jié)合，阻止垂體產(chǎn)生卵泡刺激素和黃體生成素，從而減少卵巢分泌雌激素。采用諾雷德建立的動物模型成功模擬了下丘腦性－垂體性閉經(jīng)，經(jīng)處理后的大鼠失去原有的動情周期。動物解剖時可見子宮卵巢的形態(tài)均發(fā)生了萎縮現(xiàn)象。諾雷德動物模型的卵巢組織中的雌、孕激素受體均有顯著下降，由于激素受體的含量受垂體激素LH(黃體生成素)和FSH(卵泡刺激素)的調(diào)整，可以推測諾雷德對大鼠下丘腦－垂體功能產(chǎn)生抑制作用。

3.2 仙靈脾對大鼠卵巢組織中雌、孕激素受體的影響

動物模型建立成功后，分別采用苯甲酸雌二醇和仙靈脾進行治療，治療結(jié)束后檢測卵巢組織中雌、孕激素受體的含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在卵巢組織中，雌激素組的雌激素受體比諾雷德組有顯著增高，但孕激素受體無明顯變化，仙靈脾組的雌激素受體和孕激素受體較諾雷德組有顯著升高，兩組的雌激素受體無顯著差異。該研究結(jié)果表明，仙靈脾和雌激素都可以修復卵巢雌激素受體，但只有仙靈脾具有修復卵巢孕激素受體的效果，因此，仙靈脾的修復作用更具優(yōu)勢。既往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)［2］，仙靈脾對米非司酮處理過大鼠卵巢組織的雌孕激素受體同樣具有修復作用，但尚無研究探討其對諾雷德處理過的大鼠卵巢組織是否有修復作用。

3.3 仙靈脾對大鼠卵巢組織Fas和Bcl－2表達的影響

細胞凋亡促進基因Fas和細胞凋亡抑制基因Bcl－2都存在于卵巢組織中，對卵泡發(fā)育發(fā)揮重要作用［3］，諾雷德組大鼠卵巢組織中Fas水平顯著升高，Bcl－2則明顯降低，說明諾雷德通過促進細胞凋亡對大鼠卵巢功能產(chǎn)生抑制作用，而通過雌激素治療后的大鼠卵巢組織中細胞凋亡因子水平?jīng)]有明顯增加，說明雌激素不能通過修復細胞凋亡過程達到修復卵巢功能的作用，而仙靈脾組的Fas和Bcl－2水平及基本接近正常狀態(tài)，仙靈脾可以通過修復細胞凋亡過程修復卵巢功能。

3.4 仙靈脾對雌孕激素受體的改善作用

仙靈脾，味甘辛、性溫、入肝腎二經(jīng)，具有補腎、壯陽、祛風除濕之功效，李時珍在《本草綱目》中稱其能“益精氣，堅筋骨、補腰膝、強心力，乃手足陽明三焦命門藥也，真陽不足者益之”。其主要成分為黃酮類成分，實驗證明，能促進精液分泌、改善免疫系統(tǒng)功能、改善心血管的流量，且在抗衰老、鎮(zhèn)靜、催眠、抗疲勞等方面有作用，能增強下丘腦－垂體－卵巢軸及腎上腺皮質(zhì)軸，胸腺軸等內(nèi)分泌系統(tǒng)的分泌功能［4］。仙靈脾有溫補腎陽之功，使腎氣充足，血海充盈，則經(jīng)自調(diào)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，仙靈脾通過改善卵巢組織中的細胞凋亡過程修復卵巢功能，進而上調(diào)卵巢組織中雌、孕激素受體的水平。這為臨床實踐中，采用雌激素和仙靈脾聯(lián)合治療提高療效提供了理論依據(jù)。

5 展望

隨著生活節(jié)奏的加快及社會的發(fā)展，女性工作壓力不斷增加，大腦皮層處于長期緊張狀態(tài)，下丘腦功能受到抑制，由此引起月經(jīng)稀發(fā)甚至閉經(jīng)等亞健康狀態(tài)。另外，藥流人流后引起的稀發(fā)月經(jīng)、閉經(jīng)日益增多。臨床上多采用人工周期治療，一般治療周期為3～6個月，停藥后的月經(jīng)失調(diào)復發(fā)成為治療該病的難點之一。中醫(yī)藥治療本病的特點是從整體入手，改善人體的狀態(tài)，如果說人工周期治療是治標，那么中西醫(yī)聯(lián)合治療應(yīng)該是一種標本兼治的好辦法。但中藥治療個體差異大，用藥方法繁瑣，難以標準化，臨床依從性較差。因此，本研究致力于采用仙靈脾這一傳統(tǒng)中藥的單劑型進行治療，仙靈脾具有性激素樣作用，能夠明顯提高性腺對促性腺激素的反應(yīng)，藥味少，易于堅持，長期應(yīng)用，未見副作用，有深入研究價值。一方面，可明顯改善生殖軸的功能，另一方面，改善機體整體狀態(tài)，為今后治療此種疾病提供理論依據(jù)。

［1］ 巴文君，孫麗萍，張秋菊，等.補骨脂對初老小鼠體內(nèi)雌孕激素水平作用實驗研究［J］.中醫(yī)藥學報，2010，38(5):19 －21.

［2］ 金富銳.仙車飲對RU486處理后大鼠雌孕激素受體的改善作用［J］.中醫(yī)藥學報，2006，23(2):63 －64.

［3］ 李梅，李志凌，李紅發(fā).多囊卵巢綜合征卵巢小卵泡上凋亡調(diào)控蛋白 Bax、Bcl－2 及 Fas、FasL 的表達［J］.實用醫(yī)學雜志，2004，20(9):1027－1029.

［4］ 許青媛.淫陽藿對大鼠性腺功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，1996，12(2):22 －23.