張 震，付 聰，王冰一，竇蒙蒙，趙繼敏，黃幼田，趙明耀#

1)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系鄭州450001 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室鄭州450001

(2010-12-31收稿 責(zé)任編輯 李沛寰)

地塞米松(dexamethasone，DEX)和活性維生素1，25-(OH)2D3是臨床和實(shí)驗(yàn)中使用的腫瘤誘導(dǎo)分化劑，分屬類固醇類激素和非類固醇類激素兩大家族，前者的受體是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，后者的受體是在細(xì)胞核內(nèi)。它們作為配體在轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)調(diào)控上有明顯的不同。作者觀察了這2種藥物單獨(dú)及聯(lián)合使用對食管鱗狀細(xì)胞癌EC1細(xì)胞的增殖與細(xì)胞周期的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和細(xì)胞 RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(天津 TBD 公司)，DEX、1，25-(OH)2D3、RNase、MTT 和 DMSO(美國 Sigma公司)，EC1細(xì)胞(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室惠贈)。DEX和1，25-(OH)2D3均采用無水乙醇溶解，配置成10－4mol/L儲存液，使用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋成相應(yīng)的工作濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 EC1細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)為10% 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合至70%～80%時(shí)，用胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液。①溶劑對照組:體積分?jǐn)?shù)0.1%的無水乙醇作用EC1細(xì)胞。②DEX組:用10－7mol/L DEX處理EC1 細(xì)胞。③1，25-(OH)2D3組:用 10－7mol/L 1，25-(OH)2D3處理EC1細(xì)胞。④聯(lián)合用藥組:10－7mol/L DEX 和 10－7mol/L 1，25-(OH)2D3處理 EC1細(xì)胞。各組細(xì)胞經(jīng)藥物作用48、72和96 h后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 EC1細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 采用MTT法。將制成的單細(xì)胞懸液，按1.5×104L－1的密度分別接種到3塊96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h;按1.2分組分別加藥處理細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，再分別培養(yǎng)48、72和96 h;每孔加入5 g/L的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;吸去上清，加入200μL DMSO，室溫下振蕩10 min使紫色結(jié)晶全部溶解，在96孔酶標(biāo)儀上以空白對照孔調(diào)零，570 nm處讀取吸光度(A)值。

1.4 EC1細(xì)胞周期檢測 應(yīng)用流式細(xì)胞儀法。于3塊6孔培養(yǎng)板每孔接種約2.5×105個(gè)細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，棄去無血清培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入新RPMI 1640完全培養(yǎng)基，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，分別作用48、72和96 h。將各組細(xì)胞用2 g/L胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄去上清;用PBS洗2遍，離心后棄上清，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的冰乙醇固定，4℃過夜;上機(jī)前1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，PBS洗3遍;加入1 mL PBS制成細(xì)胞懸液，加入5 g/L RNaseA 10μL，室溫放置1 h;調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/管，加入100 mg/L碘化丙啶液50μL，避光30 min，上機(jī)每個(gè)樣本檢測10 000個(gè)細(xì)胞周期的改變，計(jì)算處于G0/G1期EC1細(xì)胞比率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0進(jìn)行分析。采用2×2×3析因設(shè)計(jì)的方差分析比較各組EC1細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DEX和1，25-(OH)2D3及聯(lián)合用藥對 EC1細(xì)胞形態(tài)的影響 與溶劑對照組比較，藥物作用96 h后，DEX組、1，25-(OH)2D3組及聯(lián)合用藥組 EC1細(xì)胞生長緩慢，均未見細(xì)胞死亡現(xiàn)象(圖1)。

圖1 藥物作用96 h各組EC1細(xì)胞的形態(tài)(×200)A:溶劑對照組;B:DEX組;C:1，25-(OH)2 D3組;D:聯(lián)合用藥組。

2.2 DEX 和1，25-(OH)2D3對 EC1細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期G0/G1期的影響 見表1。

表1 DEX 和1，25-(OH)2D3對 EC1細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期G0/G1期的影響(n=3)

3 討論

根據(jù)腫瘤的正負(fù)信號調(diào)控理論，細(xì)胞癌變是因?yàn)檎{(diào)控細(xì)胞生長正信號分子過多而負(fù)信號分子過少，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)高增殖、低分化及低凋亡等生物學(xué)特征。而腫瘤的誘導(dǎo)分化治療，是在誘導(dǎo)分化劑的作用下，使腫瘤細(xì)胞被誘導(dǎo)，重新向正常細(xì)胞方向分化，表現(xiàn)為細(xì)胞生長、形態(tài)、基因表達(dá)和生物標(biāo)志物接近正常細(xì)胞狀態(tài)。地塞米松通過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)受體發(fā)揮作用，體內(nèi)大多數(shù)組織存在地塞米松受體，因此地塞米松的作用非常廣泛。臨床上應(yīng)用大劑量的糖皮質(zhì)激素抗炎、抗過敏、抗免疫排斥反應(yīng)和抗休克［1］。研究［2-3］表明糖皮質(zhì)激素與腫瘤有著密切的關(guān)系，該激素對肝癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞有抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用。1，25-(OH)2D3除了具有鈣磷代謝的功能之外，還是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑，影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，在前列腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤治療中表現(xiàn)出明確的誘導(dǎo)分化作用［4-5］。

作者采用1，25-(OH)2D3單獨(dú)或與 DEX聯(lián)合作用于EC1細(xì)胞，均顯示對EC1細(xì)胞增殖的抑制效果。相關(guān)研究［6-9］顯示，在細(xì)胞內(nèi) 1，25-(OH)2D3首先與高親和力的特異性受體VDR發(fā)生結(jié)合，與配體結(jié)合的VDR再與視黃酸X受體形成異源二聚體后，即可與靶基因上游的維生素D反應(yīng)元件結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體，從而激活或抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，從而調(diào)控 p53、pRb、p21、p27等腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)。而糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生的抑制增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期的信號是通過p21/WAF1的表 達(dá) 完 成 的［10］。該 研 究 結(jié) 果 顯 示，1，25-(OH)2D3單獨(dú)或與DEX聯(lián)合將EC1細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，并且2種藥物在這兩個(gè)作用上具有交互效應(yīng)，提示這2藥可能均通過p21/WAF1而發(fā)揮細(xì)胞周期G0/G1期阻滯作用。進(jìn)一步探討其中機(jī)制有助于提高細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑抗腫瘤效應(yīng)。

［1］楊國興，蘇永華.糖皮質(zhì)激素與腫瘤的關(guān)系［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2009，18(8):3

［2］陳慶強(qiáng)，黃嘉瑜，陳力舟.地塞米松在晚期肝癌中的臨床應(yīng)用［J］.中華現(xiàn)代中西醫(yī)雜志，2004，2(3):265

［3］徐明娟，方國恩，崔英，等.地塞米松對人卵巢癌細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體的調(diào)節(jié)［J］.上海醫(yī)學(xué)，2003，26(1):53

［4］辛星，萬獻(xiàn)堯，畢麗巖.維生素D3及其受體的臨床意義［J］.醫(yī)學(xué)與哲學(xué)，2010，31(4):44

［5］尹貽貞，劉兆鵬.活性維生素D3的抗腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用［J］.生命的化學(xué)，2009，29(4):552

［6］ Swami S，Raghavachari N，Muller UR，et al.Vitamin D growth inhibition of breast cancer cells:gene expression patterns assessed by cDNA microarray［J］.Breast Cancer Res Treat，2003，80(1):49

［7］ Wang QM，Jones JB，Studzinski GP.Cyclin-dependent kinase inhibitor p27 as a mediator of the G1-S phase block induced by 1，25-dihydroxyvitamin D3 in HL60 cells［J］.Cancer Res，1996，56(2):264

［8］ Liu M，Lee MH，Cohen M，et al.Transcription activation of the Cdk inhibitor p21 by vitamin D3 leads to the induced differentiation of the myelomonocytic cell line U937［J］.Genes Dev，1996，10(2):142

［9］ van den Bemd GJ，Pols HA，van Leeuwen JP.Antitumor effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3 and vitamin D3 analogs［J］.Curr Pharm Des，2000，6(7):717

［10］Park JH，Oh EJ，Choi YH，et al.Synergistic effects of dexamethasone and genistein on the expression of Cdk inhibitor p21WAF1/CIP1 in human hepatocellular and colorectal carcinoma cells［J］.Int J Oncol，2001，18(5):997