蘇建華，林 偉，陳玉芳，丁新生，唐金榮，肖 杭，包德誠

1)江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科金壇213200 2)常州市第四人民醫(yī)院病理科常州213001 3)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科南京210029 4)南京醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用神經(jīng)毒理研究所南京210029

(2010-04-13收稿 責(zé)任編輯 李沛寰)

細胞凋亡的分子機制極其復(fù)雜，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有助于神經(jīng)元免受低氧和糖缺失的損害，并且能刺激軸突生長和改善背根神經(jīng)元的存活，從而直接發(fā)揮神經(jīng)保護作用［1-3］。丁咯地爾是一種血管活性藥物，能阻滯血管平滑肌腎上腺素能受體兼弱Ca2+拮抗作用［4-5］，其對周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)元有確切的保護作用［6］。作者建立周圍神經(jīng)嵌壓傷動物模型，以丁咯地爾預(yù)處理后應(yīng)用TUNEL法和免疫組織化學(xué)SP法檢測不同時間點細胞凋亡和VEGF表達的變化，探討丁咯地爾對周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)元保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 丁咯地爾(批號021104，南京金陵藥業(yè)有限公司產(chǎn)品)，免疫組織化學(xué)SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TUNEL凋亡試劑盒(武漢博士德公司產(chǎn)品)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。常規(guī)神經(jīng)分離設(shè)備一套由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室提供。

1.2 大鼠周圍神經(jīng)嵌壓傷動物模型的建立 參照Patro等［7］的方法制作周圍神經(jīng)嵌壓傷動物模型:大鼠用30 g/L戊巴比妥10 mL/kg麻醉，仰臥固定于鼠板上，于右后肢腹股溝處切開皮膚1 cm，鈍性分離肌肉組織，顯露坐骨神經(jīng)，擠壓坐骨神經(jīng)，持續(xù)30 s，關(guān)閉切口，常規(guī)注射青霉素預(yù)防感染。

1.3 動物分組與處理 SD大鼠84只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。禁食12 h，分3組，每組28只，雌雄各半。正常組不給藥;丁咯地爾組給予丁咯地爾40 mg/(kg·d)，腹腔注射，共 14 d;模型組按 0.8 mL/(kg·d)腹腔注射生理鹽水，共14 d，常規(guī)飼養(yǎng)。正常組坐骨神經(jīng)顯露后即關(guān)閉切口，其余2組大鼠制作周圍神經(jīng)嵌壓傷動物模型。

1.4 背根神經(jīng)節(jié)的分離 各組分別于模型制備后6、12、24、48、72、96 h 和 7 d 處死實驗大鼠 4 只，參照文獻［8］的方法，處死大鼠立即切開背部皮膚，沿脊柱兩側(cè)剪斷與之相連的肋骨，取出胸腰段脊柱，置于含飽和氧的DMEM液(pH 7.4)培養(yǎng)皿內(nèi)。然后由脊柱正中剖開椎管從內(nèi)側(cè)小心分離L1～5背根神經(jīng)節(jié)，置于體積分數(shù)10%甲醛溶液中。

1.5 背根神經(jīng)元凋亡細胞的檢測 采用TUNEL法，標記步驟按試劑盒提供的操作手冊進行，DAB顯色。凋亡細胞呈棕褐色和棕黃色，胞核固縮，顆粒深染。各組各時間點隨機抽取4個標本進行檢測，每張切片400倍光鏡下任取5個視野分別計數(shù)相應(yīng)的細胞凋亡數(shù)，取均值。

1.6 背根神經(jīng)元的VEGF免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)SP法。載玻片采用APES涂片;切片常規(guī)脫蠟至水;體積分數(shù)3%H2O2去離子水孵育5～10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化酶;對抗原進行熱修復(fù);滴加一抗VEGF鼠抗人單克隆抗體(1-150稀釋)，4℃冰箱過夜，PBS沖洗3次2 min;滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，室溫孵育20～30 min，PBS沖洗3次2 min;DAB顯色;自來水沖洗;蘇木精復(fù)染，脫水透明，封片;400倍鏡下觀察。VEGF表達以胞質(zhì)呈褐黃色顆粒為陽性細胞。各組各時間點隨機抽取4個標本進行檢測，每張切片任取5個視野分別計數(shù)相應(yīng)VEGF陽性表達數(shù)，取均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SAS 6.12進行分析，各組同一時間點和同一時間點不同組間凋亡細胞數(shù)和VEGF陽性表達數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點各組背根神經(jīng)元凋亡細胞計數(shù)見表1。

2.2 不同時間點各組背根神經(jīng)元細胞VEGF蛋白的表達 見圖1和表2。

表1 不同時間點各組背根神經(jīng)元凋亡細胞計數(shù)(n=4) 個

圖1 各組背根神經(jīng)元VEGF免疫組織化學(xué)染色(SP，×400)A:正常組;B:模型組;C:丁咯地爾組。

表2 不同時間點各組細胞VEGF蛋白的表達(n=4) 個

3 討論

鑒于神經(jīng)血管構(gòu)筑及其生理的特點，當(dāng)某些因素使神經(jīng)血流量減少，神經(jīng)組織因缺氧而發(fā)生水腫，體積增大，管腔內(nèi)壓力增高，導(dǎo)致神經(jīng)嵌壓加重，造成神經(jīng)代謝、傳導(dǎo)功能障礙而出現(xiàn)臨床癥狀;短期內(nèi)嵌壓不能糾正者，大量的神經(jīng)軸突會發(fā)生變性甚至壞死［9］。Dahlin［10］指出急慢性壓迫可引起神經(jīng)微循環(huán)受損，使神經(jīng)內(nèi)膜血管通透性增加、束膜下水腫形成、軸漿轉(zhuǎn)運障礙，從而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。作者的研究結(jié)果顯示:正常組大鼠背根神經(jīng)元細胞少見凋亡。模型組在坐骨神經(jīng)嵌壓傷后6 h神經(jīng)細胞即出現(xiàn)凋亡，24 h繼續(xù)增多，72 h時達高峰，96 h～7 d凋亡細胞逐漸減少;而丁咯地爾組于模型制備后6 h也開始出現(xiàn)凋亡細胞，但各期凋亡數(shù)均較同期模型組減少，提示丁咯地爾可減輕坐骨神經(jīng)嵌壓后背根神經(jīng)元的病理損傷。

最近研究［2-3，11］認為:VEGF 是促進血管內(nèi)皮細胞分裂和增殖的有絲分裂源，通過激活內(nèi)皮細胞上的磷脂酶C短暫地誘導(dǎo)Ca2+釋放，對內(nèi)皮細胞的生長起刺激和趨化作用，在體內(nèi)可誘導(dǎo)血管生成，直接發(fā)揮神經(jīng)保護作用。新近研究［12-13］也認為:在脊髓損傷，甚至周圍神經(jīng)損傷中，VEGF對神經(jīng)元均具有神經(jīng)保護作用。但對其機制尚未達成共識［12，14］。大鼠坐骨神經(jīng)嵌壓傷后，VEGF除正常組輕度表達外，24 h起模型組和丁咯地爾組背根神經(jīng)元細胞VEGF表達均開始增加，丁咯地爾組于模型制備后48～72 h表達達到高峰，7 d時丁咯地爾組仍有較高表達，其表達的數(shù)量較模型組明顯增加且持續(xù)時間延長。提示丁咯地爾可提高嵌壓后大鼠背根神經(jīng)細胞VEGF的表達。

綜上所述，坐骨神經(jīng)嵌壓后背根神經(jīng)元廣泛凋亡，丁咯地爾可通過上調(diào)VEGF來抑制坐骨神經(jīng)嵌壓傷后背根神經(jīng)元凋亡。

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