劉章鎖，王建軍

1)河南省煤炭總醫(yī)院胸外科鄭州450011 2)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胸外科武漢430022

(2010-09-15收稿 責(zé)任編輯 姜春霞)

食管癌是發(fā)病率較高的一種惡性腫瘤，病理分型中鱗狀細(xì)胞癌占95%，其生物學(xué)行為特點(diǎn)是侵襲性高，常發(fā)生局部浸潤、累及臨近淋巴結(jié)、淋巴播散及由血源性播散引起廣泛轉(zhuǎn)移，術(shù)后5 a生存率僅20% ～36%［1］。腫瘤細(xì)胞侵襲黏附是腫瘤重要的生物學(xué)行為之一，是惡性腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵一步。反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)技術(shù)能夠干預(yù)腫瘤的生物學(xué)行為，逐漸成為腫瘤基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用ASODN技術(shù)，研究血管生成素樣蛋白3(angiopoietin-like protein 3，ANGPTL3)對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706侵襲黏附能力的影響，探討ANGPTL3 ASODN對(duì)食管癌浸潤轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 EC9706細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所。ASODN由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。其他試劑均為進(jìn)口超純級(jí)或國產(chǎn)分析純以上級(jí)產(chǎn)品。主要實(shí)驗(yàn)儀器為:日本O-lympus CK40型倒置顯微鏡，美國Applied Biosystems PCR擴(kuò)增儀，大連Jim-X Scientific凝膠圖像分析系統(tǒng)，美國Costar細(xì)胞培養(yǎng)板和Transwell小室，南京華東電子集團(tuán)公司產(chǎn)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

1.2 EC9706細(xì)胞培養(yǎng) 將EC9706細(xì)胞凍存管迅速投入37℃恒溫水浴箱中解凍，無菌操作將凍存管內(nèi)的EC9706細(xì)胞移入離心管，離心(1 000 r/min)約10 min，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮沉淀的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，置37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)80% ～90%時(shí)，吸盡細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，用PBS液沖洗細(xì)胞2遍，加入2.5 g/L胰蛋白酶1 mL，倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大時(shí)，加入體積分?jǐn)?shù)10%RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化，棄去消化液，向瓶底加入2 mL PBS液制成細(xì)胞懸液，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 ASODN及RT-PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank收錄的ANGPTL3 mRNA序列，設(shè)計(jì)針對(duì)翻譯起始部位的ASODN，作用在ANGPTL3的翻譯起始密碼子(AUG)后的18個(gè)堿基序列，其序列為5’-AAGGAGCTTAATTGTGAA-3’，經(jīng)微機(jī)檢索與ANGPTL3基因以外的人類基因無同源性。同時(shí)合成隨機(jī)錯(cuò)義寡核苷酸(scrambled oligodeoxynucleotide，SCODN)，其 序 列 為 5’-TACGGATCCAATG CGACG-3’，經(jīng)過微機(jī)檢索與人類基因無同源性。由北京賽百盛生物公司合成，均進(jìn)行硫代磷酸化修飾，即寡核苷酸磷酸二酯鍵內(nèi)非連接氧被硫取代。部分寡核苷酸采用5’FAM熒光素標(biāo)記。引物經(jīng)PAGE純化，凍干分裝，－20℃保存。

1.4 脂質(zhì)體-寡核苷酸混合液的制備 先用無血清不含抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基把ASODN配成20 μmol/L貯存液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌貯存。Lipofectamine 2000 4℃保存，轉(zhuǎn)染基因前以試驗(yàn)需要的濃度將兩者在室溫下混勻30 min，形成脂質(zhì)體-寡核苷酸混合液，其中寡核苷酸(μg)-脂質(zhì)體(μg)=1-2。

1.5 體外細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104mL－1，接種200μL于96孔板，培養(yǎng)24 h。將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、ASODN組和SCODN組，分別在轉(zhuǎn)染后30、60、90和120 min于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm波長處測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞黏附率。黏附率=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.6 體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞分為3組，同1.5。將轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞消化，吸取400μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)48 h，常規(guī)HE染色，隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞侵襲抑制率。細(xì)胞侵襲抑制率=(對(duì)照組每視野下侵襲細(xì)胞數(shù)－ASODN組每視野下侵襲細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組每視野下侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0進(jìn)行分析，3組間EC9706細(xì)胞黏附率和侵襲細(xì)胞數(shù)目的比較采用單因素方差分析和 SNK-q檢驗(yàn)，SCODN組和ASODN組間侵襲抑制率的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài) 顯微鏡下可見EC9706細(xì)胞貼壁生長，多呈多角形，排列緊密。細(xì)胞核異形性明顯，核仁清楚，胞質(zhì)豐富(圖1)。ASODN轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的分布較未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組明顯稀疏，細(xì)胞體積變小，皺縮呈圓形，胞核及胞質(zhì)輪廓折射增強(qiáng)，較粗糙;部分細(xì)胞不再貼壁生長，懸浮于培養(yǎng)液中(圖2)。

2.2 不同組別EC9706細(xì)胞黏附率比較 結(jié)果見表1。

表1 不同組別EC9706細(xì)胞黏附率

2.3 不同組別EC9706細(xì)胞侵襲能力比較 結(jié)果見圖 2、表 2。

表2 不同組別EC9706細(xì)胞侵襲能力

3 討論

腫瘤細(xì)胞侵襲黏附是腫瘤重要的生物學(xué)行為之一。惡性腫瘤細(xì)胞侵襲黏附能力決定著腫瘤新生血管形成和腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)而影響惡性腫瘤臨床治療效果。ANGPTL3是一種分泌性蛋白因子［2］，結(jié)合于整合素αvβ3受體后，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和遷移，具有刺激鼠角膜血管生成的作用［3］。整合素可與基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMPs)結(jié)合并正向調(diào)控MMPs的表達(dá)，從而直接破壞和降解ECM，為瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移做了充分的準(zhǔn)備［4］。

ASODN技術(shù)是根據(jù)核酸雜交原理，設(shè)計(jì)以序列特異性方式與DNA或RNA分子中的互補(bǔ)堿基序列結(jié)合，通過直接干擾或抑制RNA編碼蛋白的產(chǎn)生而阻斷基因的表達(dá)，以達(dá)到控制和治療腫瘤的作用。研究［5］發(fā)現(xiàn)，肝素酶ASODN可有效降低肝素酶蛋白及mRNA的表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。該實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ANGPTL3 ASODN轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞，觀察對(duì)EC9706細(xì)胞黏附和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，ASODN能明顯降低EC9706細(xì)胞的黏附能力，同時(shí)EC9706細(xì)胞侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)明顯下降，侵襲抑制率顯著升高。提示ANGPTL3 ASODN可能通過降低EC9706細(xì)胞中侵襲黏附相關(guān)基因，從而減弱食管癌腫瘤細(xì)胞的侵襲黏附生物學(xué)行為。

［1］ Bando E，Yonemura Y，Endou Y，et al.Immunohistochemical study of MT-MMP tissue status in gastric carcinoma and correlation with survival analyzed by univariate and multivariate analysis［J］.Oncol Rep，1998，5(6):1483

［2］ Conklin D，Gilbertson D，Taff DW，et al.Identification of a mammalian angiopoietin-related protein expressed specifically in liver［J］.Genomics，1999，62(3):477

［3］ Camenisch G，Pisabarro MT，Sherman D，et al.ANGPTL3 stimulates endothelial cell adhesion and migration via integrin alpha beta3 and induces blood vessel formation in vivo［J］.JBiol Chem，2002，277(19):17281

［4］ Fishman DA，Liu Y，Ellerbroek SM，et al.Lysophosphatidic acid promotes matrix metalloproteinase(MMP)activation and MMP-depend invasion in ovarian cancer cells［J］.Cancer Res，2001，61(7):3194

［5］陳奎生，張嵐，唐琳，等.肝素酶反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染的人食管癌EC9706細(xì)胞中肝素酶 mRNA的表達(dá)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2004，39(2):181