張忠順 樓海 肖和平

（同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院／上海市結(jié)核病［肺] 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 上海 200433）

結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（TST）作為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染（LTBI）的診斷方法已近一個(gè)世紀(jì)，但該方法存在許多不足之處，如對(duì)于卡介苗（BCG）接種過的人和NTM感染者其特異性不高，對(duì)于免疫抑制者其敏感性也不高［1]。近年來采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）法定量檢測受檢者全血或外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異抗原的IFN－γ釋放反應(yīng)，已被多個(gè)國家的FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于結(jié)核菌潛伏感染的診斷［2－3]，國內(nèi)外的許多研究也表明其對(duì)于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的診斷具有很高的敏感性和特異性，同時(shí)也得到越來越多同行者的肯定［4－7]。為此，本研究通過IFN－γ釋放試驗(yàn)（IGRA）來了解我院結(jié)核病專業(yè)人員及密切接觸者的結(jié)核分枝桿菌潛伏感染情況，為結(jié)核病防治部門的專業(yè)人員制定相關(guān)有效的保護(hù)政策和措施提供有力依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 所選對(duì)象均經(jīng)影像學(xué)、臨床表現(xiàn)排除活動(dòng)性結(jié)核病變。

1.1.1 結(jié)核病專業(yè)人員組128例（其中醫(yī)生60例，護(hù)士68例），結(jié)核病專業(yè)人員組為上海市肺科醫(yī)院結(jié)核科住院病房的專業(yè)人員，年齡20～50歲，結(jié)核科工作年限6個(gè)月～18年，平均3.8年，中位年限3年；同時(shí)根據(jù)與結(jié)核患者暴露程度及時(shí)間分成2組：工作年限＜3年的結(jié)核病專業(yè)人員組和工作年限≥3年的結(jié)核病專業(yè)人員組。

1.1.2 病人家屬密切接觸組60例，病人家屬密切接觸組為長期陪護(hù)在反復(fù)菌陽患者身邊的家屬，年齡23～56歲，陪護(hù)年限2年～10年，平均4.6年。

1.1.3 非密切接觸組40例。非密切接觸組為排除與結(jié)核病患者有密切接觸的健康醫(yī)學(xué)生，且均無陳舊性結(jié)核病病灶，年齡20～30歲。

由于IGRA用于診斷兒童結(jié)核病尚有爭議，本研究選取受試者年齡均大于15歲，白細(xì)胞水平均無明顯下降（＞4×109／L），同時(shí)無艾滋病病毒（HIV）感染、妊娠、使用免疫抑制劑或增強(qiáng)劑、嚴(yán)重肝腎功能衰竭史。

1.2 儀器和試劑 ESCO二級(jí)生物安全柜，36℃，5%CO2，90%濕度培養(yǎng)箱，γ－干擾素釋放試驗(yàn)試劑盒：T－SPOT.TB（Oxford Immunotec，Abingdon，UK）（即結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)檢測試劑盒，由上海復(fù)星長征公司提供）。

1.3 方法

1.3.1 收集血液 肝素抗凝管收集外周靜脈血3～4ml，收集之后立刻顛倒5～10次，18～25℃存放。

1.3.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離將3ml血液與3ml預(yù)熱的AIM－V混勻，1 600g，18℃，離心28min；用吸管吸起白細(xì)胞層，加人預(yù)溫培養(yǎng)基AIM－V至10ml離心600g，7min；棄去上清，加 AIM－V 至10ml，離心350g，7min，棄去上清，將沉淀懸浮于0.5ml AIM－V中；取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度在2.0×109／L～3.0×109／L。

1.3.3 體外ELISPOT方法檢測γ－干擾素分泌性T淋巴細(xì)胞 （1）檢測過程：分別加入50μl培養(yǎng)基（陰性控制）、陽性控制、結(jié)核菌特異抗原A和B于對(duì)應(yīng)的檢測孔，每孔加入100μl細(xì)胞懸液，于36℃，5%CO2，90%濕度培養(yǎng)箱3孵浴20～24h，PBS洗飯4次。加入50μl工作酶復(fù)合物溶液于每個(gè)孔中，5℃孵浴60min，200μl PBS洗板4次，加入50μl BCIP／NBT底物溶液至各個(gè)檢測孔中，室溫放置7min，蒸餾水洗滌各孔。干燥后觀察各孔。（2）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)，A或B孔計(jì)數(shù)—陰性孔計(jì)數(shù)≥6，結(jié)果判斷為陽性；如果陰性對(duì)照斑點(diǎn)數(shù)≥6，A或B孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性孔斑點(diǎn)數(shù)判定為陽性；如果A、B孔計(jì)數(shù)不夠，且陽性對(duì)照反應(yīng)良好，則為陰性。

表1 各組IGRA陽性率比較

表2 結(jié)核病專業(yè)人員IGRA陽性結(jié)果

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組IGRA結(jié)果 表1。結(jié)核病專業(yè)人員組總的陽性率為14.8%（19／128）高于非密切接觸組的5.0%（2／40），但2者差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；家屬密切接觸組的陽性率為23.3%（14／60）高于非密切接觸組的5.0%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝6.002，P＝0.023）；以密切接觸為暴露因素和非密切接觸組比較，其RR值及95%CI分別為4.67（1.12～19.43）。同時(shí)家屬密切接觸者陽性率高于結(jié)核病專業(yè)人員組的陽性率，但2者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)核病專業(yè)人員組中醫(yī)生的陽性率16.7%（10／60）和護(hù)士的陽性率13.2%（9／68）分別與非密切接觸組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但都有不同程度的升高。結(jié)核病專業(yè)人員組中PPD總的陽性率高達(dá)87.5%（112／128）。

2.2 工作年限≥3年的結(jié)核病專業(yè)人員陽性結(jié)果分布情況 表2。結(jié)核病專業(yè)人員中工作年限≥3年的醫(yī)生有24例、護(hù)士有35例。其總的IGRA陽性率為27.1%（16／59），其中醫(yī)生33.3%（8／24）高于護(hù)士 22.9%（8／35），亦高于家屬密切接觸組23.3%（14／60）。工作年限≥3年的結(jié)核病專業(yè)人員總的IGRA陽性率27.1%（16／59）較非密切接觸組5.0%（2／40）明顯高，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.840，P＝0.007）；以工作年限≥3年的結(jié)核病專業(yè)人員組和非密切接觸組比較，其RR值及95%CI分別為5.42（1.32～22.31）；工作年限＜3年者，其總的陽性率為4.4%，與非密切接觸者相仿。我們對(duì)結(jié)核病專業(yè)人員進(jìn)行了4個(gè)月隨訪，未發(fā)現(xiàn)陽性者轉(zhuǎn)陰，也未發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核的征象。

3 討論

結(jié)核病專業(yè)人員常年處在結(jié)核分枝桿菌傳染的高發(fā)區(qū)域，其潛在感染的危險(xiǎn)性一直是我們需要了解和關(guān)心的，其客觀具體的結(jié)核潛伏感染率是制定相關(guān)保護(hù)政策和措施的有力依據(jù)之一。臨床通常以PPD強(qiáng)陽性或近期由陰性轉(zhuǎn)為陽性，而無臨床結(jié)核病證據(jù)者判斷為潛伏感染，但在像我國高卡介苗接種率和結(jié)核病高發(fā)的國家，其TST皮膚試驗(yàn)存在很高的假陽性和假陰性［8－9]。本試驗(yàn)中結(jié)核病專業(yè)人員組中PPD總的陽性率高達(dá)87.5%（112／128）也證實(shí)了這一點(diǎn)。近年來新出現(xiàn)了1種IFN－γ釋放試驗(yàn)，其通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）或者酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISPOT）檢測T細(xì)胞對(duì)早期分泌靶抗原6（ESAT－6）和培養(yǎng)分泌蛋白10（CFP－10）的免疫反應(yīng)來判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌的感染。這2種蛋白具有高度菌株特異性，在BCG和大多數(shù)其他非結(jié)核分枝桿菌包括鳥胞內(nèi)分枝桿菌中都不存在，國外資料報(bào)道其檢測結(jié)核分枝桿菌感染的敏感性達(dá)85%～90%，特.性 達(dá) 91% ～96%［3，10]。.種IGRA的試劑盒的出現(xiàn)，為我們本次研究了解結(jié)核病專業(yè)人員的結(jié)核潛伏感染率提供了一種可靠的檢測手段。

本研究證實(shí)，結(jié)核病專業(yè)人員組和家屬密切接觸組的γ－干擾素試驗(yàn)陽性率均高于非密切接觸組的陽性率。尤其是家屬密切接觸者，其陽性率高達(dá)23.3%（14／60），與非密切接觸組5.0%（2／40）比較，2者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其受結(jié)核分枝桿菌感染的危險(xiǎn)性是非密切接觸者的4.67倍，說明家屬密切接觸者受結(jié)核分枝桿菌感染的危險(xiǎn)性是相當(dāng)高的。同時(shí)家屬密切接觸者的陽性率高于結(jié)核病專業(yè)人員的14.8%（19／128）。究其原因可歸納為2個(gè)方面：一是在本試驗(yàn)中，家屬密切接觸組選取的是長期陪護(hù)在反復(fù)菌陽患者身邊的家屬，其平均陪護(hù)時(shí)間為4.6年。而這些患者大部分是耐藥者，其療程長、痰菌陽性易反復(fù)，決定了家屬必需對(duì)其給予長期耐心而細(xì)致地服侍。這樣就進(jìn)一步增加了其被傳染的可能性［11]。二是結(jié)核病專業(yè)人員畢竟經(jīng)過專業(yè)的教育和培訓(xùn)，對(duì)結(jié)核病的傳染性具有一定的防范意識(shí)，以及受工作年限不同等因素的影響，其總的結(jié)核潛伏感染率較家屬密切接觸者低。但由于常年處在菌陽率較高的環(huán)境中，其結(jié)核潛伏感染率又較非密切接觸者明顯為高。

分析結(jié)核病專業(yè)人員陽性結(jié)果分布可知，工作年限≥3年的結(jié)核病專業(yè)人員，其潛伏感染率高達(dá)27.1%（16／59），較非密切接觸組5.0%（2／40）明顯高，2者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；工作年限≥3年的結(jié)核病專業(yè)人員感染結(jié)核分枝桿菌的相對(duì)危險(xiǎn)度是非密切接觸者的5.42倍。而工作年限＜3年的結(jié)核病專業(yè)人員總的陽性率為4.4%，與非密切接觸者相仿。說明結(jié)核病專業(yè)人員人員受結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的危險(xiǎn)性與接觸時(shí)間成正比。同時(shí)工作年限≥3年的醫(yī)生的陽性率更是高達(dá)33.3%（8／24），高于家屬密切接觸組的23.3%。原因可能有二：一是在結(jié)核病房內(nèi)，大部分是結(jié)核分枝桿菌活動(dòng)性很強(qiáng)的耐藥肺結(jié)核患者和未使用抗結(jié)核藥的初治患者，他們的傳染性都是很強(qiáng)的而且菌種多樣，同時(shí)工作年限≥3年的醫(yī)生絕大部分又擔(dān)任著結(jié)核門診的診治任務(wù)。因此這些結(jié)核病專業(yè)人員長期與患者近距離接觸，其被感染的可能性必然會(huì)加大［11]。較之家屬密切接觸者，他們被侵犯的菌種單一，使用抗結(jié)核藥物后結(jié)核分枝桿菌的毒性和傳染性可以得到很好的消弱，其潛伏感染率必然較工作年限≥3年的結(jié)核病專業(yè)人員低。二是在如此高濃度結(jié)核分枝桿菌的環(huán)境中，依據(jù) WHO的要求，結(jié)核病房相對(duì)來講應(yīng)是個(gè)封閉的負(fù)壓環(huán)境，而且應(yīng)具備其他相應(yīng)的硬件防范措施。但在發(fā)達(dá)國家實(shí)施這樣的結(jié)核病防范規(guī)范，預(yù)防一個(gè)職業(yè)性結(jié)核患者要花費(fèi)數(shù)百萬美元［12]。因此在我國及大多數(shù)低收入國家這一點(diǎn)是很難做到，大部分結(jié)核病房與一般的普通病房沒有太大的區(qū)別［13]。硬件防護(hù)措施的不到位進(jìn)一步增加了結(jié)核病專業(yè)人員被結(jié)核菌感染的危險(xiǎn)性。

結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者是發(fā)生結(jié)核病的高危人群，且結(jié)核病專業(yè)人員又處在抗擊結(jié)核病的第一線，因此目前我國結(jié)核病專業(yè)人員潛伏感染的嚴(yán)重性應(yīng)引起我們的高度重視。加強(qiáng)對(duì)結(jié)核病專業(yè)人員的自身防范已刻不容緩。在對(duì)結(jié)核病專業(yè)人員自身防范知識(shí)宣傳和培訓(xùn)的同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)結(jié)核病房消毒和隔離硬件設(shè)施的投入，這也是切斷結(jié)核病院內(nèi)感染傳染鏈的重要一環(huán)［6]。本研究中結(jié)核病專業(yè)人員被結(jié)核分枝桿菌感染的比率較之西方發(fā)達(dá)國家報(bào)道［7，14]的明顯為高，進(jìn)一步說明了目前我們對(duì)結(jié)核病專業(yè)人員的防范措施存在著很大的不足。尤其是在今天我國這種高耐藥結(jié)核?。∕DR－TB和XDRTB）快速蔓延的形勢下，其對(duì)結(jié)核病專業(yè)人員和患者的危害性將更大，因此及時(shí)而有效地對(duì)其防范政策和措施作出相應(yīng)的調(diào)整和補(bǔ)充，健全適合我們自己的結(jié)核病職業(yè)生物安全防范規(guī)范就顯得尤為重要。

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