戴廣明 曹以誠 杜正平 陳洵 黃曙海 逄宇 周楊 黃海榮 趙雁林

（1.北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所 北京 101149；2.華南理工大學(xué) 廣州 510640；3.廣西疾病預(yù)防控制中心 南寧 530000）

細(xì)菌學(xué)檢查是發(fā)現(xiàn)結(jié)核病傳染源的主要途徑和手段，是確定結(jié)核病診斷和化療方案的重要依據(jù)。但由于敏感性低或所需時(shí)間過長等原因，致使結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查一直不能滿足臨床診治的需求，存在延誤診斷和誤診情況，同時(shí)也耽誤了患者得到及時(shí)治療的時(shí)間，影響了治療效果，也使得疾病的傳播難于控制。因此，缺乏早期、準(zhǔn)確和廉價(jià)的診斷技術(shù)是制約全球結(jié)核病控制的嚴(yán)重障礙。

近年發(fā)展起來的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），完全突破了傳統(tǒng)分子生物學(xué)檢測技術(shù)需要昂貴儀器設(shè)備以及繁雜操作的限制，給分子生物學(xué)診斷技術(shù)的廉價(jià)普及帶來了希望。該方法最初是由Notomi等［1]設(shè)計(jì)來用于病原微生物的檢測，技術(shù)的工作原理是利用4條不同的特異性引物識別靶基因的6個(gè)特定區(qū)段，在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)?；虻臄U(kuò)增和產(chǎn)物的檢測可一步完成，擴(kuò)增效率高，可在15～60min擴(kuò)增109～1010倍。所有靶基因序列的檢測可只通過擴(kuò)增產(chǎn)物的有、無來判別。結(jié)果的判斷很簡單，主要有以下兩種方式：（1）反應(yīng)結(jié)束后直接在紫外燈光下判讀有無擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物形成；（2）核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2＋結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，應(yīng)用濁度儀檢測沉淀濁度來判定［2]。由于方法簡單易行，即使是沒有分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員也只需1周的訓(xùn)練就可掌握。

本文對國內(nèi)建立的結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）快速檢測方法進(jìn)行了介紹和評價(jià)，結(jié)果如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本室保存的31株分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，48株臨床結(jié)核分枝桿菌。

1.1.2 結(jié)核分枝桿菌（LAMP法）基因快速檢測試劑盒（以下簡稱LAMP檢測試劑盒）由我們和華南理工大學(xué)共同研發(fā)，基因組DNA純化試劑盒（Genomic DNA Purification Kit）購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測目標(biāo)菌株和靶標(biāo)引物 結(jié)核分枝桿菌基因快速檢測方法的目標(biāo)菌株確定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，包括結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium bovis）、非洲結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium africanum）和田鼠結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium microti）。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［3]和預(yù)實(shí)驗(yàn)，靶標(biāo)確定為編碼DNA解旋酶B亞基的gyrB基因，通過序列分析獲得保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物（圖1），內(nèi)引物為FIP和BIP，外引物為F3和B3（引物設(shè)計(jì)軟件為華南理工大學(xué)開發(fā)的LAMP引物設(shè)計(jì)專用軟件）。引物序列為FIP：ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGttttAGAAGTCGGAACCCCT 和 BIP：ATACGACTTCGAAACCGTCGCCttttGGTCAGCCCCTTGTTGAG， F3： GGGTACGAGTGGTCTCAGG，B3：CGTCTTGGGTCACCCTCT。

1.2.2 DNA模板制備 取對數(shù)生長期的分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床結(jié)核分枝桿菌，用滅菌蒸餾水分別懸浮于1.5ml離心管中高溫滅菌后，8000r／min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中作為粗制模板DNA?；?qū)⑸锨逡汉图?xì)胞沉淀用基因組DNA純化試劑盒（Genomic DNA Purification Kit）提取基因組DNA作為精制的模板DNA。

圖1 目標(biāo)菌gyrB基因序列高度一致的保守區(qū)域（紅框中是引物識別靶基因的6個(gè)特定區(qū)段）

圖2 LAMP反應(yīng)結(jié)果（綠色的是有發(fā)生特異性擴(kuò)增的陽性管，橙色的為陰性管）

1.2.3 LAMP擴(kuò)增反應(yīng) 結(jié)核分枝桿菌（LAMP法）基因快速檢測試劑盒包括20支LAMP反應(yīng)管和陽性標(biāo)準(zhǔn)管、陰性標(biāo)準(zhǔn)管各1支。每支LAMP反應(yīng)管為1個(gè)LAMP反應(yīng)體系，分為大小2個(gè)腔。大腔含有1.6μmol／L FIP引物、1.6μmol／L BIP 引物、0.4μmol／L F3 引 物、0.4μmol／L B3 引 物、1mol／L Betaine溶液、6mmol／L MgSO4溶液、8U Bst DNA 聚合酶、1.6mmol／L dNTP溶液、2.5μL 10×Thermo Pol Buffer，小腔含2μL核酸染料，最后上面覆蓋一層石蠟油（25μL）以防止污染。陽性標(biāo)準(zhǔn)為卡介苗核酸溶液，陰性標(biāo)準(zhǔn)為樣品處理液。將粗制模板DNA 2.5μL或精制模板DNA 1μL加入LAMP反應(yīng)管的大腔底部，置65℃恒溫反應(yīng)60min即可。每次反應(yīng)都應(yīng)加陰性標(biāo)準(zhǔn)模版、陽性標(biāo)準(zhǔn)模版作為對照。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 在50μl PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，含有10×緩沖液5μl，上下游引物各 0.1μM （F3：GGGTACGAGTGGTCTCAGG，B3： CGTCTTGGGTCACCCTCT ）， 0.2mM dNTP，2μM MgCl2，1.5UTaq DNA 聚合酶及100ngDNA模板。在PE－9700擴(kuò)增儀上94℃預(yù)變性5min后，進(jìn)行30次下述循環(huán)：94℃1min，58℃1min和72℃1min，72℃延伸7min。最后取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠（其中含40μl／ml溴乙錠）中進(jìn)行電泳，時(shí)間為1h。電泳完畢，用讀膠儀拍照，并用標(biāo)準(zhǔn)DNA 1 500bp ladder進(jìn)行帶型大小比較結(jié)果判定。

1.2.4 結(jié)核桿菌H37Rv基因組DNA稀釋實(shí)驗(yàn)取結(jié)核桿菌H37Rv培養(yǎng)物作為原液，用滅菌蒸餾水懸浮于1.5ml離心管，高溫滅菌后，用純化試劑盒（Genomic DNA Purification Kit）提取基因組DNA作為底液作10倍梯度稀釋，共稀釋10個(gè)梯度。然后以其做模版進(jìn)行l(wèi)amp檢測。

1.2.5 重復(fù)對照實(shí)驗(yàn) 分別由本室實(shí)驗(yàn)員和華南理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)員對相同的樣品進(jìn)行重復(fù)對照測試。

1.2.6 結(jié)果判斷 取出反應(yīng)管，冷卻至室溫，顛倒LAMP反應(yīng)管，使大小腔反應(yīng)物混勻。其結(jié)果可以通過肉眼觀察到的顏色變化來判斷，顏色立即變綠的是有發(fā)生特異性擴(kuò)增的陽性管，變橙色的為陰性管。若陰陽性對照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)的靈敏度和特異性試驗(yàn) 取本室保存分枝桿菌31株標(biāo)準(zhǔn)菌株和48株臨床結(jié)核分枝桿菌的DNA模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如表1和圖2所示。從圖2可以看到，顏色立即變綠的是發(fā)生特異性擴(kuò)增的陽性管，變橙色的為陰性管。在相同反應(yīng)條件下，LAMP方法能迅速的檢測出結(jié)核桿菌復(fù)合群，包括結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis）、非洲分枝桿菌（Mycobacterium africanum）和田鼠分枝桿菌（Mycobacterium microti）。華南理工大學(xué)的檢測結(jié)果為56株菌為陽性，23株菌為陰性，其中潰瘍分枝桿菌（M.ulcerans）和鳥分枝桿菌（M.avium）不屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的菌株也為陽性。以實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)和16SrRNA測序結(jié)果作為金標(biāo)，從表2可計(jì)算得出特異度為92.0%，靈敏度為100.0%。北京結(jié)研所的檢測結(jié)果為57株菌為陽性，22株菌為陰性，其中恥垢分枝桿菌（M.smegmatis）、副偶發(fā)分枝桿菌（M.parofortuitum）和不產(chǎn)色分枝桿菌（M.nonchromogenicum）不屬于結(jié)核桿菌復(fù)合群的菌株也為陽性。從表3可計(jì)算得出特異度為88.0%，靈敏度為100.0%。PCR擴(kuò)增和金標(biāo)的結(jié)果相同，都是54株菌為陽性，25株菌為陰性。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株P(guān)CR擴(kuò)增和LAMP檢測結(jié)果

表2 華南理工大學(xué)LAMP檢測結(jié)果a

表3 北京結(jié)研所檢測結(jié)果a

2.1 LAMP反應(yīng)最低檢出限的計(jì)算 將結(jié)核桿菌H37Rv提取基因組DNA并稀釋10個(gè)梯度，用LAMP檢測試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果第1到第4個(gè)梯度的稀釋液為陽性，其余梯度都為陰性（表2）。結(jié)核桿菌H37Rv基因組DNA原液經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量為58ng／ml，從Genbank查結(jié)核桿菌基因組大約為4.41Mbp，最后計(jì)算得出每個(gè)lamp反應(yīng)體系最低檢出限為12個(gè)拷貝。

表4 結(jié)核桿菌H37Rv基因組DNA稀釋液lamp方法檢測結(jié)果a

3 討論

從LAMP技術(shù)的原理和以上檢測結(jié)果來看，LAMP方法的靈敏度同現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的PCR方法一致，能完全滿足目前結(jié)核分枝桿菌檢測的需要。每個(gè)lamp反應(yīng)體系最低檢出限可達(dá)到12個(gè)拷貝，這一點(diǎn)要優(yōu)于PCR方法。結(jié)核分枝桿菌（LAMP法）基因快速檢測試劑盒的目標(biāo)菌株為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，而我們的檢測結(jié)果中潰瘍分枝桿菌（M.ulcerans）、鳥分枝桿菌（M.avium）、恥垢分枝桿菌（M.smegmatis）、副偶發(fā)分枝桿菌（M.parofortuitum）和不產(chǎn)色分枝桿菌（M.nonchromogenicum）都不屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的菌株也為陽性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，LAMP檢測試劑盒可穩(wěn)定檢出目標(biāo)菌，但部分非目標(biāo)菌存在不確定的干擾。該方法對非目標(biāo)菌存在的不確定干擾從序列上分析是不存在的。我 們.LAMP 的 外 引.（F3：GGGTACGAGTGGTCTCAGG，B3：CGTCTTGGGTCACCCTCT）作為上下游引物，常規(guī)PCR擴(kuò)增目的片段。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與培養(yǎng)和16SrRNA測序所得的結(jié)果一致。據(jù)此可確定，潰瘍分枝桿菌（M.ulcerans）等5株菌的檢測結(jié)果為假陽性。

假陽性的產(chǎn)生有很多原因，國內(nèi)也有類似文獻(xiàn)報(bào)道［4]。因北京結(jié)研所和華南理工大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室都要常規(guī)進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，DNA交叉污染的可能性較大，故推測影響本實(shí)驗(yàn)特異性結(jié)果的因素很可能為模板的污染問題。實(shí)驗(yàn)者可以通過規(guī)范的操作和特殊處理來減少污染的機(jī)會(huì)，比如隔離混合反應(yīng)液和檢測結(jié)果的房間，經(jīng)常進(jìn)行實(shí)驗(yàn)工具和實(shí)驗(yàn)臺(tái)的清洗，和加入dUTP偶聯(lián)尿嘧啶－N－糖苷酶（UDG）來防止擴(kuò)增產(chǎn)物的污染［5]。

目前的LAMP技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn)：（1）恒溫?cái)U(kuò)增，不需特殊試劑，不需預(yù)先雙鏈DNA變性。（2）高特異性：應(yīng)用6個(gè)區(qū)段，4種引物進(jìn)行擴(kuò)增。（3）快速、高效擴(kuò)增：整個(gè)擴(kuò)增在1h內(nèi)即可完成，且產(chǎn)率可達(dá)到0.5mg／ml。使用環(huán)狀引物可以在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上縮短1／3～1／2的時(shí)間［6]。（4）不需要昂貴的儀器設(shè)備，檢測方法簡單，結(jié)果判定直接。該方法的特點(diǎn)和優(yōu)勢可以使之在基層實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場監(jiān)測方面廣泛使用，在快速檢測方面具有光明的應(yīng)用前景。因此自LAMP技術(shù)發(fā)明以來，其被廣泛的應(yīng)用于病原體基因檢測等領(lǐng)域［7－9]。國外的結(jié)核分枝桿菌LAMP快速檢測試劑試用結(jié)果表明［10－11]，該方法對痰涂片和痰培養(yǎng)都陽性標(biāo)本的檢測靈敏度為97.7%；而對于涂片陰性但培養(yǎng)陽性標(biāo)本的靈敏度為48.8%；對培養(yǎng)陰性的標(biāo)本特異性為99.0%。目前，國外此類LAMP快速檢測試劑尚未在國內(nèi)銷售，而且觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要價(jià)格高昂的配套設(shè)備，不適于在廣大基層實(shí)驗(yàn)室開展。為此，我們開發(fā)了具有自主版權(quán)的LAMP引物設(shè)計(jì)軟件，提高了設(shè)計(jì)效率和引物成功率。而且通過LAMP反應(yīng)管的專利設(shè)計(jì)，徹底解決了“氣溶膠”干擾，實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增后不開蓋判讀檢測結(jié)果，有效避免了交叉污染。

因?yàn)樵摲椒ㄖ饕獞?yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室的結(jié)核桿菌診斷，所以適用性是關(guān)系到該技術(shù)能否被廣大基層醫(yī)務(wù)工作者接受的關(guān)鍵因素之一。從目前試用情況來看，我們建立的結(jié)核分枝桿菌LAMP快速檢測方法將操作者的操作步驟降到最少，交叉污染的可能性也降到了很低水平，而且具有所需設(shè)備簡單、操作容易、價(jià)格低廉等優(yōu)勢。因此，LAMP技術(shù)的應(yīng)用，將會(huì)大幅度提高結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)率，并將對我國結(jié)核病控制工作的順利進(jìn)行提供有力的保障。

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