陳 稚,劉新光,林曉芳,譚熒飛,陳偉賢,馮杰雄,朱敏豪,吳都督

(廣東醫(yī)學(xué)院分析中心,廣東東莞 523808）

[Cu(Phen)(5-Fu)2](NO3)2配合物與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜研究

陳 稚,劉新光,林曉芳,譚熒飛,陳偉賢,馮杰雄,朱敏豪,吳都督

(廣東醫(yī)學(xué)院分析中心,廣東東莞 523808）

以Cu(Ⅱ)作為中心離子,5-氟脲嘧啶(5-Fu)和鄰菲咯啉(Phen)作為配體,合成了[Cu(Phen)(5-Fu)2](NO3)2配合物;利用元素分析和紅外光譜分析了配合物的組成和化學(xué)結(jié)構(gòu);利用熒光光譜考察了其與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.結(jié)果表明,配合物與BSA作用可導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光猝滅;其猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅,速率常數(shù)為7.38×1012L·mol-1·s-1,結(jié)合常數(shù) Ka=2.13×106L·mol-1,結(jié)合位點數(shù) n=1.39.與此同時,該配合物能夠猝滅BSA分子表面95.4%的色氨酸(Trp)殘基,是良好的BSA淬滅劑.

銅(Ⅱ)配合物;牛血清白蛋白;相互作用;熒光光譜

Abstract:A complex[Cu(Phen)(5-Fu)2](NO3)2was designed and synthesized with Cu(NO3)2,fluorouracil(5-Fu),and 1,10-phenanthrotine(Phen)as the starting materials.The composition and chemical structure of resultant complex were analyzed by means of elemental analysis and infrared spectrometry.The interaction of[Cu(Phen)(5-Fu)2](NO3)2with bovine serum albumin(BSA)in Tris-HCl buffer system(p H=6.50)was studied using fluorescence spectrometry.It was found that the interaction between the complex and BSA resulted in quenching of endogenous fluorescence of BSA.The quenching process could be described with static quenching mechanism,with quenching rate constant being 7.38×1012L ·mol-1·s-1,binding constant being 2.13×106L ·mol-1and binding site number being 1.39.In the meantime,the complex could quench 95.4%of tryptophan(Trp)residue on the surface of BSA,showing promising potential as a candidate quenching agent for BSA.

Keywords:copper(Ⅱ)complex;bovine serum albumin;interaction;fluorescence spectrometry

蛋白質(zhì)和金屬配合物及藥物分子相互作用的研究是近年來的研究熱點之一[1].血清白蛋白是血漿中最為豐富的蛋白質(zhì),它具有廣泛的結(jié)合能力,能與許多內(nèi)源及外源性化合物結(jié)合.藥物分子進(jìn)入人體后,通常與血清白蛋白以分子間作用力結(jié)合,實現(xiàn)在血漿中儲存、運輸、到達(dá)靶部位進(jìn)而發(fā)生藥理作用,因而其作為體外研究藥物的結(jié)合與運輸模型備受重視[2].而5-氟脲嘧啶(5-Fu)是目前研究較多的抗癌藥物之一,它能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶的作用,阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶核苷酸,干擾DNA的合成,對食管癌、肝癌具有較好的治療作用[3].研究5-Fu與血清白蛋白的相互作用,有利于了解藥物與蛋白質(zhì)的作用機(jī)制,為5-Fu的修飾和病理研究提供理論基礎(chǔ).另外,Cu是人體中重要的微量元素,它能調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的吸收和血紅蛋白的合成,是多種酶的輔基,在生命活動中起著重要的作用[4].因此,研究Cu(Ⅱ)對藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的影響,有助于了解藥物在體內(nèi)的輸送和作用機(jī)制,闡明金屬離子在體內(nèi)的生理作用.

雖然目前研究5-Fu與血清白蛋白相互作用的文獻(xiàn)較多[5-6],但以5-Fu為配體的Cu(Ⅱ)配合物與血清白蛋白的作用研究尚未有文獻(xiàn)報道,因此,作者以Cu(Ⅱ)為中心離子,5-Fu和鄰菲咯啉(Phen)為配體,合成了[Cu(Phen)(5-Fu)2](NO3)2配合物,并利用熒光光譜考察了該配合物與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用,并探討其作用機(jī)理.

1 實驗部分

1.1 試劑

牛血清白蛋白:生化試劑,上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司;三羥甲基氨基甲烷:分析純,中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;5-氟脲嘧啶,1,10-鄰菲咯啉:分析純,天津科密歐化學(xué)試劑公司;Cu(NO3)2,無水乙醇,NaCl:分析純,廣東番禺化學(xué)試劑廠.

1.2 配合物的合成

在加熱到80℃并攪拌條件下,依次將1 mmol Cu(NO3)2,3 mmol 5-Fu,10 mmol Phen的無水乙醇溶液混合,待有沉淀生成后,降低反應(yīng)溫度至40℃,反應(yīng)5 h,靜置過夜,抽濾.產(chǎn)品經(jīng)無水乙醇和乙醚洗滌,真空干燥后即得.

1.3 配合物分析

配合物的Cu(Ⅱ)含量用二甲酚橙作指示劑,用 EDTA絡(luò)合返滴定法測定,C、H、N元素分析用 Flash EA1112型元素分析儀(美國OI公司)測定,紅外光譜用FTS175C-UMA500型傅利葉紅外光譜儀(美國Bio-Rad公司)測定.

1.4 配合物與BSA的相互作用

牛血清白蛋白和配合物均用0.05 mol·L-1,p H=6.50的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl緩沖溶液配制,以0.10 mol·L-1NaCl溶液維持離子強(qiáng)度,所用水為二次蒸餾水.

熒光光譜測定過程:在28℃下,移取2.0 mL 1.0×10-5mol·L-1BSA于1 cm石英池中,用微量進(jìn)樣器逐次加入1.0×10-4mol·L-1配合物的水溶液進(jìn)行熒光實驗,每次加入溶液后混合均勻,以290 nm為激發(fā)波長,在天津F-4600日立熒光光譜儀(天津市金貝爾科技有限公司)上記錄220～550 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜,狹縫2 nm,掃描速度2 400 nm/min,電壓700 V.

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的表征

2.1.1 配合物的結(jié)構(gòu)

配合物為藍(lán)綠色粉末狀固體,配合物Cu(Ⅱ)的含量和C、H、N元素分析數(shù)據(jù),以及按預(yù)期配合物化學(xué)式[Cu(Phen)(5-Fu)2](NO3)2計算的理論值見表1.由表1中數(shù)據(jù)可見,實驗值與理論值基本一致,因此確定配合物的化學(xué)式為[Cu(Phen)(5-Fu)2](NO3)2.

表1 配合物的元素分析Table 1 Data of elemental analysis %

2.1.2 配合物的紅外光譜

表2列舉了2種配體的主要紅外特征吸收峰在形成配合物前后的變化.由表2可見,5-Fu的νC=O和νC=C在配合物中均發(fā)生了紅移,但酮基位移較大,這說明與Cu(Ⅱ)配位的可能是羰基上的氧.而鄰菲咯啉的紅外光譜也發(fā)生了變化:C-H振動由858 cm-1和739 cm-1移動至852 cm-1和734 cm-1,頻率變化不大,說明phen的基本骨架未變;C=N伸縮振動由原來的1 587 cm-1移動到1 571 cm-1,向低波數(shù)移動了17 cm-1,這與文獻(xiàn)報道相似[7];而C=N伸縮振動則由1 645 cm-1移動到1 632 cm-1;這些特征峰不同程度地向低波數(shù)移動,表明鄰菲咯啉的2個N原子上的孤對電子可能與Cu(Ⅱ)發(fā)生雙齒配位,形成了鰲合環(huán).而這2種配體主要吸收峰波數(shù)發(fā)生移動的表現(xiàn),說明此兩種配體確實與Cu(Ⅱ)發(fā)生了作用.

表2 配體和配合物的主要紅外吸收峰Table 1 Principal IR band frequencies of the complex and ligands cm-1

2.2 配合物與BSA的作用

2.2.1 BSA的熒光猝滅效應(yīng)

蛋白質(zhì)分子中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)可作為內(nèi)源熒光探針檢測蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化.A類蛋白質(zhì)(不含 Trp,只含Phe和 Tyr)熒光光譜主要表現(xiàn) Tyr的特征,最大發(fā)射波長約為304 nm.B類蛋白質(zhì)(含有 Trp)熒光光譜則主要表現(xiàn) Trp的特征,最大熒光發(fā)射在310～360 nm之間.處于蛋白質(zhì)分子表面的 Trp殘基具有350～353 nm的熒光發(fā)射峰,而包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部的 Trp殘基的熒光發(fā)射峰在326～342 nm之間,處于非極性環(huán)境的 Trp殘基的熒光發(fā)射峰在310～324 nm附近[8].

BSA由于含有色氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸殘基,因而具有較強(qiáng)的內(nèi)源熒光;而配合物溶液熒光強(qiáng)度很弱,對BSA的熒光發(fā)射光譜無影響.本實驗以290 nm為激發(fā)波長,記錄220～550 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜,結(jié)果如圖1所示.由圖1可以發(fā)現(xiàn),BSA在350 nm附近有一強(qiáng)的熒光發(fā)射峰,說明是由BSA分子表面的Trp殘基產(chǎn)生.隨著配合物濃度的增加,雖然BSA的熒光發(fā)射光譜的峰位和峰形不變,但其內(nèi)源熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅,即其熒光強(qiáng)度逐漸降低,表明BSA與配合物發(fā)生了作用.

2.2.2 配合物對BSA的熒光猝滅機(jī)理

如果熒光體BSA與猝滅體配合物是由于熱運動等發(fā)生碰撞而引起B(yǎng)SA的熒光猝滅,則這種動態(tài)猝滅服從Stern-Volmer方程:

其中 F0為猝滅體不存在時熒光體的熒光強(qiáng)度,F為加入猝滅體后的熒光強(qiáng)度,Kq為雙分子猝滅常數(shù),[Q]為猝滅體濃度(即配合物濃度),τ0為猝滅體不存在時熒光體的熒光壽命,KD為Stern-Volmer常數(shù).根據(jù)公式(1),將350 nm處的 F0/F對所加入配合物總濃度[Q]作圖,得到該配合物對BSA的Stern-Volmer猝滅曲線(見圖2):F0/F=7.38×104[Q]+0.501,r=0.997.該曲線的斜率即為配合物的 KD值.由于生物分子的熒光壽命τ0約為10-8s,因此可計算得到配合物表觀猝滅常數(shù) Kq(Kq= KD/τ0)為7.38×1012L·mol-1·s-1.各種猝滅劑對生物分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)約為2.0×1010L·mol-1·s-1[9],而實驗所得的表觀猝滅常數(shù) Kq遠(yuǎn)大于其擴(kuò)散控制的猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1,所以猝滅過程不可能是因為分子擴(kuò)散和碰撞所引起的動態(tài)猝滅,而是由于配合物與BSA發(fā)生配位引起的靜態(tài)猝滅.

圖1 配合物濃度對BSA熒光光譜的影響Fig.1 Effects of the complex on the fluoresence emission spectra of BSA

圖2 BSA與配合物作用的Stern-Volmer方程曲線Fig.2 Stern-Volmer quenching plot of BSA withincreasing concentration of complex

2.2.3 配合物與BSA的結(jié)合位點數(shù) n、結(jié)合穩(wěn)定常數(shù) K的計算

對于靜態(tài)猝滅,由熒光強(qiáng)度與猝滅劑濃度的關(guān)系,可求得熒光分子與猝滅劑的結(jié)合常數(shù).設(shè)BSA有 n個相同且獨立的結(jié)合位點,則有:

則結(jié)合穩(wěn)定常數(shù) K為:

式(3)中[BSA]、[Q]和[QnBSA]分別為作用達(dá)到平衡時的游離BSA的濃度、配合物濃度以及配合物-BSA復(fù)合物的濃度.

若熒光體BSA的總濃度為[BSA]0,則[BSA]0=[QnBSA]+[BSA].當(dāng)[Q]>[BSA]0時,可以用猝滅劑配合物的起始濃度代替其平衡濃度,則:

在靜態(tài)猝滅中,體系的熒光強(qiáng)度 F與其游離濃度成正比(所生成的配合物-BSA復(fù)合物是非熒光性的),即:

由(4)和(5)式可推得:

以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖,應(yīng)為一條直線,直線斜率為結(jié)合位點數(shù)n,而由直線截距可以求得配合物與BSA結(jié)合的穩(wěn)定常數(shù) K值(見圖3).由圖3的數(shù)據(jù),最后求得結(jié)合常數(shù) K=2.13×106L·mol-1,結(jié)合位點數(shù)n=1.39.可見,配合物與BSA可形成一個結(jié)合位點,而且結(jié)合常數(shù)比較大,說明兩者之問具有較強(qiáng)的結(jié)合力,配合物可以在體內(nèi)被蛋白質(zhì)運輸、儲存.

2.2.4 配合物猝滅BSA分子中Trp殘基的百分?jǐn)?shù)

由Stern-Volmer方程推導(dǎo)可得[8]:

其中 fa為可被熒光猝滅劑接近的發(fā)色基團(tuán)占總的發(fā)色基團(tuán)的百分比;KD為可被熒光猝滅劑Q所接近的發(fā)色基團(tuán)的Stern-Volmer猝滅常數(shù).作 F0/(F0-F)～ 1/[Q]曲線如圖4,求得 fa=0.954,即配合物能夠猝滅BSA分子中95.4%的 Trp殘基.由此可見,作者合成的[Cu(Phen)(5-Fu)2](NO3)2配合物對于BSA來說是一種很好的淬滅劑,它與BSA有特定的結(jié)合位點,但結(jié)合部位的定位及結(jié)合過程中構(gòu)象如何變化還有待于進(jìn)一步研究.

圖3 lg(F0-F)/F與lg[Q]關(guān)系曲線圖Fig.3 The relationship between lg(F0-F)/Fand lg[Q]

圖4 F0/(F0-F)與1/[Q]關(guān)系曲線圖Fig.4 The relationship betweenF0/(F0-F)and 1/[Q]

3 結(jié)論

以Cu(Ⅱ)為中心離子,5-Fu和 Phen為配體,合成了[Cu(Phen)(5-Fu)2](NO3)2配合物,并在p H為6.50的條件下,用熒光光譜法研究了該配合物與BSA結(jié)合反應(yīng)的特征.該配合物對BSA具有熒光猝滅作用,該猝滅過程為靜態(tài)猝滅,結(jié)合位點數(shù) n=1.39,具有一個結(jié)合位點;其結(jié)合常數(shù)為2.13×106L·mol-1,與BSA具有較強(qiáng)的相互作用,能夠結(jié)合形成較穩(wěn)定的配合物.另外,該配合物能夠猝滅BSA分子中表面95.4%的 Trp殘基,是一種很好的BSA淬滅劑.

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Fluorescence spectrometric study of interaction between complex[Cu(Phen)(5-Fu)2](NO3)2and bovine serumalbumin

CHEN Zhi,LIU Xin-guang,LIN Xiao-fang,TAN Ying-fei,CHEN Wei-xian,FENGJie-xiong,ZHU Min-hao,WU Du-du

(Center of Analysis,Guangdong Medical College,Dongguan523808,Guangdong,China)

O 623.662

A

1008-1011(2011)02-0025-05

2010-11-08.

廣東省大學(xué)生創(chuàng)新實驗項目(KY1037)與廣東省衛(wèi)生廳項目(B2009190).

陳稚(1979-),女,碩士,研究方向為藥物分析和生物化學(xué).