賀建武，劉祝祥，龍華，朱泓溢，肖建青，譚周才，陳義光

(吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首416000)

波賽鏈霉菌JMC 06001抑菌活性物質(zhì)的特性研究

賀建武，劉祝祥，龍華，朱泓溢，肖建青，譚周才，陳義光*

(吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首416000)

使用藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Asperillus niger)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、變形桿菌(Proteus vulgaris)、白色念珠菌(Candida albicans)、青霉(Penicillium sp.)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)9種指示菌，采用杯碟法檢測(cè)抑菌活性。研究了波賽鏈霉菌JMC 06001菌株(Streptomyces peucetius JMC 06001)發(fā)酵液和菌絲體中活性物質(zhì)的抑菌譜，對(duì)由該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的溫度、pH值、抗紫外線方面的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。利用硅膠柱層析和薄層層析對(duì)抑菌物質(zhì)的分離也做了初步的研究。結(jié)果表明，該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)部分革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌和部分真菌有較為明顯的抑制作用。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的最適溫度為40℃左右，最佳pH值在7.0左右，具有較好的熱穩(wěn)定性和較寬的pH作用范圍，抗紫外線輻射能力較強(qiáng)。通過(guò)硅膠柱層析分離和薄層色譜檢測(cè)，顯示該菌次生代謝產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)包含了多種成分。

波賽鏈霉菌;抑菌譜;穩(wěn)定性

波賽鏈霉菌(Streptomyces peucetius)能合成多種具有很強(qiáng)抑菌活性的物質(zhì)［1］，該菌作為生產(chǎn)多種抗腫瘤抗生素的重要菌株而受到研究人員的青睞［2-3］。菌株JMC 06001系由本課題組從高鹽泥樣中分離到的1株放線菌，根據(jù)該菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征、細(xì)胞分化特征和基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，被鑒定為波賽鏈霉菌的1個(gè)菌株，并發(fā)現(xiàn)其抑菌活性較為突出［4］。用響應(yīng)面法對(duì)該菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，摸索出JMC 06001較為理想的發(fā)酵條件，試驗(yàn)結(jié)果另文發(fā)表。本文擬對(duì)該菌株發(fā)酵液的不同溶劑萃取組分以及菌絲體在不同溶劑中的浸出物的抑菌情況進(jìn)行研究，考察由該菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在溫度、光照、pH值等不同條件下的穩(wěn)定性，并利用柱層析和薄層指導(dǎo)下進(jìn)行活性跟蹤，對(duì)抑菌活性組分的極性大小做了初步的摸索，以期為JMC 06001菌株的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株菌株JMC 06001由吉首大學(xué)微生物資源與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室從廣東省湛江硇洲島高鹽泥樣中分離篩選所得。9株抑菌指示菌分別為藤黃八疊球菌(Sarcina lutea CGMCC 1.880)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis ATCC 6051)、大腸埃希菌(Escherichia coli ATCC 128)、黑曲霉(Asperillus niger NCPC 1003)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes ATCC 8724)、變形桿菌(Proteus vulgaris ATCC 8427)、白色念珠菌(Candida albicans NCPC 1027)、青霉(Penicillium sp.ATCC 12556)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa ATCC 27853)。以上菌株均由本實(shí)驗(yàn)室提供和保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基①菌株JMC 06001斜面培養(yǎng)基采用MA培養(yǎng)基，抑菌指示菌培養(yǎng)基采用NA培養(yǎng)基［5］;②種子培養(yǎng)基:葡萄糖15 g，甘露醇5 g，蛋白胨10 g，酵母膏1 g，牛肉膏2 g，NaCl 60 g，CaCO31 g，復(fù)合鹽A液20 mL，復(fù)合鹽B液1 mL，水1000 mL，pH 7.0;③發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，大豆粉14 g，NaCl 30 g，CaCO31 g，復(fù)合鹽A液20 mL，復(fù)合鹽B液1 mL，水1000 mL，起始pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液制備采用復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)法，按

1.1.2 培養(yǎng)基配方配制種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基于28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d后得到種子液，轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，收集發(fā)酵液，4000 r/min離心15 min，離心的發(fā)酵液和菌絲體分別于4℃下冷藏備用。

1.2.2 不同溶劑萃取物及菌絲體浸出物的制備和抑菌試驗(yàn)①不同溶劑萃取液的制備:取3份發(fā)酵液，分別用2倍量體積的乙酸乙酯、氯仿、飽和正丁醇溶液萃取，經(jīng)減壓真空濃縮至干，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，4℃下冷藏備用;②不同溶劑菌絲體浸出物的制備:取4份菌絲體，分別用甲醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯各50 mL超聲處理15 min，然后在常溫下浸出48 h后過(guò)濾，濾液經(jīng)減壓真空濃縮至干，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，4℃下冷藏備用;③抑菌譜試驗(yàn)(杯碟法［6］):用無(wú)菌平皿制備各種含指示菌的混合培養(yǎng)基，迅速放置滅過(guò)菌的牛津杯，每個(gè)杯中加入100 μL萃取物或菌絲體浸出物樣品，將培養(yǎng)皿置于28℃下培養(yǎng)24～48 h后，觀察并測(cè)量透明圈的直徑。

1.2.3 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性的測(cè)定把1.2.2項(xiàng)剩下的原液和菌絲體浸出物合并，減壓真空濃縮至干，取少量用甲醇溶解，即為含抑菌物質(zhì)的混合液，以藤黃八疊球菌為指示菌。按1.2.2項(xiàng)③的抑菌方法進(jìn)行下面的試驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。①溫度對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響:分別取上述混合液1 mL，置于EP管中，在30、40、50、60、70、80、90、100℃條件下保溫2 h，檢測(cè)抑菌活性;②pH值對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響:分別取上述混合液5 mL，用1 mol/L的HCl或1 mol/L NaOH溶液將混合液pH調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，分別于4℃下保存24 h，檢測(cè)其抑菌活性;③紫外光對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響:分別取上述混合液1 mL，置于EP管中，用紫外光照射0、5、10、15、20、25、30 min后，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.2.4 活性物質(zhì)的初步分離①取1.2.3項(xiàng)下濃縮的浸膏1 g溶于少量氯仿，采用濕法上硅膠柱(100～200目)，柱高約5 cm，以100%、60%、50%、40%、30%、20%、10%和0%的氯仿-甲醇(氯仿∶甲醇，體積比)各20 mL，進(jìn)行梯度洗脫，流速為6滴/min，用刻度試管收集，每管10 mL;②對(duì)每收集的洗脫液以藤黃八疊球菌為指示菌分別進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，找出有抑菌活性的組分;③對(duì)活性組分進(jìn)行薄層色譜分析，選用不同的展開(kāi)劑考察活性物質(zhì)的極性情況，在254 nm或365 nm波長(zhǎng)下觀察并標(biāo)記。

2 結(jié)果

2.1 抑菌譜測(cè)定

2.1.1 發(fā)酵液萃取物對(duì)多種指示菌的抑菌譜

JMC06001菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯、氯仿、正丁醇萃取物對(duì)多種指示菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵液萃取物對(duì)多種指示菌的抑制作用Table 1Inhibition effect of fermentation broth extract using the bacterium indicators

結(jié)果顯示，該菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯、氯仿、正丁醇(飽和溶液)萃取物對(duì)部分革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌和部分真菌有較為明顯的抑制作用，這表明該菌株通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)能產(chǎn)生廣譜抗菌的化合物。然而，在各萃取組分中，抑菌效果以乙酸乙酯萃取部分最為顯著。除對(duì)枯草芽胞桿菌(B.subtilis)外，對(duì)變形桿菌(P.vulgaris)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)、藤黃八疊球菌(S.lutea)、白色念珠菌(M.albican)的抑制作用都比其他組分要強(qiáng)。在各種抑菌指示菌中，對(duì)S.lutea和P.vulgaris的抑制效果最為顯著，牛津杯周圍均呈現(xiàn)出幾乎透明的抑菌圈。

2.1.2 菌絲體浸出物對(duì)多種指示菌的抑菌譜該菌株發(fā)酵培養(yǎng)后能產(chǎn)生較豐富的菌絲體，利用甲醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯對(duì)菌絲體進(jìn)行浸提，發(fā)現(xiàn)其浸出物對(duì)多種指示菌也有較強(qiáng)的抑菌作用，見(jiàn)表2。說(shuō)明該菌株的菌絲體浸出物也能對(duì)部分革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌和部分真菌有較強(qiáng)的抑制效果，表明JMC 06001菌株的胞內(nèi)也有廣譜抗菌的化合物存在。

表2 菌絲體浸出物對(duì)多種指示菌的抑制作用Table 2Inhibition effect of extract from mycelium using the bacterium indicators

2.2 抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性考察

2.2.1 溫度對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響分別取1.2.3項(xiàng)下的混合液1 mL，分別放置在30、40、50、60、70、80、90、100℃條件下保溫2 h，用杯碟法檢測(cè)抑菌活性，確定溫度對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響。由圖1可以看出，該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)活性隨著溫度的增高而略有升高，在40℃時(shí)活性最強(qiáng)，之后稍呈下降的趨勢(shì)，整個(gè)活性增強(qiáng)或減弱的幅度較小，特別是在100℃條件下處理2 h，仍具有90%左右的活性，說(shuō)明該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有較高的熱穩(wěn)定性。

圖1 溫度對(duì)菌株JMC 06001抑菌物質(zhì)活性的影響Fig.1Effect of temperature on the activity of antibacterial substance of strain JMC 06001

2.2.2pH值對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響將混合液的pH值調(diào)節(jié)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，4℃下保存24 h后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，考察pH值對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響。由圖2可以看出，pH值對(duì)該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)活性存在一定的影響，隨著pH值的提高，抑菌物質(zhì)活性相應(yīng)增強(qiáng)，當(dāng)pH值為7.0時(shí)活性最大;隨后抑菌物質(zhì)的活性隨著pH值的上升而逐漸遞減。

圖2 pH值對(duì)菌株JMC 06001抑菌物質(zhì)活性的影響Fig.2Effect of pH on the activity of antibacterial substance of strain JMC 06001

2.2.3 紫外光對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響用紫外光照射混合液0、5、10、15、20、25、30 min后，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，確定紫外光對(duì)抑菌物質(zhì)活性影響，見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，紫外光對(duì)抑菌物質(zhì)活性有輕微的抑制作用，在處理30 min后，抑菌活性仍然保持在96%的水平。

圖3 紫外光對(duì)菌株JMC 06001抑菌物質(zhì)活性的影響Fig.3Effect of ultraviolet light on the activity of antibacterial substance of strain JMC 06001

2.2.4 抑菌活性成分的初步分離通過(guò)對(duì)收集的各組分進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示第2管和第3管溶液對(duì)藤黃八疊球菌有抑菌效果，將其合并。取混合溶液進(jìn)行薄層層析，展開(kāi)劑按石油醚∶乙酸乙酯為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4(體積比)的展開(kāi)體系，在飽和碘蒸氣下熏蒸1 min后在254 nm或365 nm波長(zhǎng)下觀察，發(fā)現(xiàn)在石油醚∶乙酸乙酯= 1∶3(體積比)時(shí)展開(kāi)效果較好，但存在少量拖尾情況，于是在石油醚∶乙酸乙酯=1∶3(體積比)體系中加入了甲醇，考察石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇為1∶3∶0.1、1∶3∶0.2和1∶3∶0.3(體積比)的新體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇=1∶3∶0.1(體積比)時(shí)，分離效果較好，見(jiàn)圖4。

圖4 JMC 06001抑菌活性物質(zhì)薄層色譜圖(365 nm)Fig.4Thin layer chromatography(TLC)of antimicrobial substances from strain JMC 06001(365 nm)

通過(guò)柱層析和薄層層析的分離和檢測(cè)，初步確定菌株JMC 06001次生代謝產(chǎn)物中的抑菌活性成分可能為多種物質(zhì)的混合物，且在石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇=1∶3∶0.1(體積比)的體系中能較好地進(jìn)行分離。

3 討論

菌株JMC 06001產(chǎn)生的活性物質(zhì)抑菌譜廣，抑菌效果明顯，對(duì)部分病原菌如藤黃八疊球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、變形桿菌及真菌中的白色念珠菌均有較強(qiáng)的抑制作用，并且這些抑菌物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性和較寬的pH作用范圍，抗紫外線輻射能力較強(qiáng)，通過(guò)硅膠柱層析初步分離和薄層色譜檢測(cè)，顯示該菌次生代謝產(chǎn)物中抑菌活性成分包含了多種物質(zhì)，認(rèn)為該菌株具有一定的藥用開(kāi)發(fā)潛力。

迄今為止，研究者通過(guò)分離純化Streptomyces peucetius的發(fā)酵產(chǎn)物得到了一系列的抗腫瘤化合物［7-9］，近幾年來(lái)國(guó)外研究者主要對(duì)該菌進(jìn)行了大量的基因調(diào)控方面的研究［10-12］，而本研究分離到的JMC 06001菌株究竟能產(chǎn)生哪些類別的抑菌物質(zhì)，能否產(chǎn)生廣譜高效的抗腫瘤化合物，這些活性物質(zhì)又該如何進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)表征，如何從基因工程角度出發(fā)揭示某些特殊的基因與化合物之間的調(diào)控關(guān)系，這些問(wèn)題都將是接下來(lái)工作的重點(diǎn)。

［1］Srinivasan P，Palani SN，Prasad R.Daunorubicin efflux in Streptomyces peucetius modulates biosynthesis by feedback regulation［J］.FEMS Microbiol Lett，2010，305(1):18-27.

［2］Arcamone F，Cassinelli G，F(xiàn)antini G，et al.Adriamycin，14-hydroxydaunomycin，a new antitumor antibiotic from S.peucetius var.caesius.Reprinted from Biotechnology and Bioengineering，Vol.XI，Issue 6，Pages 1101-1110(1969)［J］.Biotechnol Bioeng，2000，67(6):704-713.

［3］Malla S，Niraula NP，Singh B，et al.Limitations in doxorubicin production from Streptomyces peucetius［J］.Microbiol Res，2010，165(5):427-435.

［4］陳義光，張曉蓉，張麗，等.具抗菌活性海洋放線菌菌株JMC 06001的分離和鑒定［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2008，35(1):40-44.

［5］黃苛，張麗，劉祝祥，等.硇洲島海膽可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性［J］.微生物學(xué)報(bào)，2009，(11):1424-1429.

［6］黃苛，劉祝祥，陳奇輝，等.具抗菌活性放線菌菌株JSM 20.1的分離和鑒定［J］.微生物學(xué)雜志，2010，30(1):27-31.

［7］Arcamone F，Cassinelli G，F(xiàn)antini G，et al.14-Hydroxydaunomycin，a new antitumor antibiotic from Streptomyces peucetius var.caesius［J］.Biotechnol.Bioeng，1969，11:1101-1110.

［8］Crespi-Perellino N，Grein A，Merli S，et al.Biosynthetic relationships among daunorubicin，doxorubicin and 13-dihydrodaunorubicin in Streptomyces peucetius［J］.Experientia，1982，38(12):1455-1456.

［9］Madduri K，Kennedy J，Rivola G，et al.Production of the antitumor drug epirubicin(4'-epidoxorubicin)and its precursor by a genetically engineered strain of Streptomyces peucetius［J］.Nat Biotechnol，1998，16(1):69-74.

［10］Parajuli N，Viet HT，Ishida K，et al.Identification and characterization of the afsR homologue regulatory gene from Streptomyces peucetius ATCC 27952［J］.Res Microbiol，2005，156(5-6): 707-712.

［11］Ghimire GP，Oh TJ，Liou K，et al.Identification of a cryptic type III polyketide synthase(1，3，6，8-tetrahydroxynaphthalene synthase)from Streptomyces peucetius ATCC 27952［J］.Mol Cells，2008，26(4):362-367.

［12］Singh B，Oh TJ，Sohng JK.Exploration of geosmin synthase from Streptomyces peucetius ATCC 27952 by deletion of doxorubicin biosynthetic gene cluster［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36(10):1257-1265.

Characteristics of Antimicrobial Substances by Streptomyces peucetius JMC 06001

HE Jian-wu，LIU Zhu-xiang，LONG Hua，ZHU Hong-yi，XIAO Jian-qing，TAN Zhou-cai，CHEN Yi-guang
(Coll.of Bio-Res.＆Envir.Sci.，Jishou Uni.，Jishou，Hunan 416000)

Antimicrobial spectrum of the fermentation broth and mycelium of Streptomyces peucetius strain JMC06001 were measured with cylinder plate method using nine indicator strains(Sarcina lutea，Bacillus subtilis，E.coli，Aspergillus niger，Enterobacter aerogenes，Proteus vulgaris，Candida albicans，Penicillium sp.，Pseudomonas aeruginosa)，and the stability of antimicrobial substance against temperatures，pH，and UV was observed.Initial research on the isolation of the antimicrobial substance by silica gel column and thin layer chromatography(TLC)was also carried out.The results suggested that the strain JMC 06001 exhibited obvious broad antimicrobial spectrum，including Gramnegative and some Gram-positive bacteria and some fungi.Stability test showed that the most suitable effective temperature and pH of antibacterial substances was 40℃and about 7.0 respectively having fairly broad pH effective range，fairly good thermo stability and fairly strong anti-UV ability.Silica gel column chromatography separation and TLC detection showed that the antimicrobial substances in the secondary metabolites of the strain contained multiple components.

Streptomyces peucetius;antimicrobial spectrum;stability

Q939

A

1005－7021(2011)01－0010－05

國(guó)家自然科學(xué)基金(30970007);吉首大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(JGY201018)

賀建武男，碩士研究生。研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與生態(tài)。E-mail:hejwu@163.com

*通訊作者。Tel:0743-8564416，E-mail:mchenjsu@yahoo.com.cn

2010-10-25;

2010-11-21