劉曉輝，陳順，陳飛，王紅旗，桓明輝，高曉梅，張巖，于廣峰，孫立梅，郭玲玲

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽122000 )

1株抑制土傳病原菌且產(chǎn)纖維素酶芽胞桿菌篩選及產(chǎn)酶條件的研究

劉曉輝，陳順，陳飛，王紅旗，桓明輝，高曉梅，張巖，于廣峰，孫立梅，郭玲玲

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽122000 )

通過剛果紅染色法和DNS分光光度法對6種芽胞桿菌分泌胞外纖維素酶進行篩選，再通過管碟法測試對5種病原菌的抑菌作用，得到1株芽胞桿菌(菌株編號為X-02)酶活達182.5 U/mL，而且對幾種土傳病害有抑制作用。并對其產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源及初始pH、發(fā)酵溫度、接種量、搖瓶轉速和時間進行優(yōu)化，結果顯示該菌株最佳碳源是2%CMC-Na，其次是葡萄糖，二者產(chǎn)酶之差只為21 U/mL?？紤]大量生產(chǎn)的成本和方便性(CMC-Na溶解慢)，選擇葡萄糖為碳源，氮源為2.0%蛋白胨與酵母膏復合氮源，在pH值為8.0、溫度37℃、接種量為2%、轉速為180 r/min、時間48 h條件下酶活達到391.0 U/mL酶液，比優(yōu)化前提高了2.1倍。

纖維素酶;芽胞桿菌;發(fā)酵;管碟法;病原菌

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種選育芽胞桿菌6株，菌種編號分別為X-01、X-02、X-03、X-04、X-05、X-06，均由本實驗室分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基①羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基(%):CMC-Na 1，蛋白胨0.5，酵母膏0.05，KH2PO40.15，MgSO40.02，NaCl 0.5，瓊脂1.5，pH 7.2～7.4;②種子培養(yǎng)基(%):葡萄糖2.0，酵母膏1.0，蛋白胨1.0，NaCl 0.5，KH2PO40.1，pH 7.0～7.5。

1.1.3 主要試劑和溶液DNS顯色液，底物溶液，標準葡萄糖溶液，CMC-Na。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶活力測定①初篩(染色法):將活化的芽胞桿菌液用滴種法滴種在CMC-Na平皿上，培養(yǎng)2～4 d，0.2%剛果紅染色30 min，依次用蒸餾水和濃度為1 mol/L的NaCl徹底洗去染液，再用5%的醋酸液固定顏色。在菌落周圍形成深紅色染色圈證明此菌分泌纖維素酶。用游標卡尺分別測量染色圈直徑和菌落直徑，根據(jù)兩者比值大小初步確定纖維素酶活性的高低;②復篩:用DNS法測酶活力。取3支20.0 mL試管，1支做空白對照，其余2支做平行樣品管。樣品管中加1.0 mL原樣酶液，然后3支試管中分別加入4.0 mL已預熱至60℃的底物溶液，在60℃水浴中準確計時20 min取出，每管立即加入1.0 mL 2.0 mol/L氫氧化鈉溶液和2.0 mL DNS顯色液，搖勻后在對照管中再加入1.0 mL原樣酶液，將3支試管置于沸水浴，準確計時顯色5 min取出，流水迅速冷卻，并用蒸餾水定容至20.0 mL，搖勻后用分光光度計在490 nm處測定吸光度值。在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μg葡萄糖的酶量定義為一個酶活單位。

對協(xié)方差Pk同步進行調(diào)整，把位置x,y,z有關的矩陣元素調(diào)整到前t行前t列，即矩陣的左上角。針對目標跟蹤應用場景，t=3。

纖維素酶活計算:U=M1－M0/20

U—樣品的酶活力，單位為μg/min

M0—對照葡萄糖量，單位為μg

M1—分解后樣品質(zhì)量，單位為μg

20—酶與底物反應時間。單位為min

1.2.2 發(fā)酵條件的初步優(yōu)化對上述篩選到的產(chǎn)酶活力最高菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源、接種量、初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和搖瓶轉速上進行優(yōu)化，以提高目的菌的產(chǎn)酶活力，酶活測定方法同DNS法。

1.2.3 X-02對5種土傳病病原菌的抑菌作用

①芽胞桿菌發(fā)酵液制取:將X-02菌種活化后接種于種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h，然后以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min，37℃，發(fā)酵48 h，過濾得到濾液備用;②5種土傳病害病原菌菌懸液的制備:將立枯絲核菌、黃瓜枯萎、韭菜根腐、番茄早疫和辣椒菌核5種病原菌接于準備好的無菌PDA試管中，28℃培養(yǎng)5 d，把培養(yǎng)好的菌種轉到帶有玻璃珠的無菌水中，充分振動10 min，備用。用管碟法測定。

2 結果

2.1 初篩結果

將各菌株分別在CMC-Na平板上以3點滴種，經(jīng)培養(yǎng)、染色后，6株在菌落周圍產(chǎn)生大小不等的水解圈，初步確定能產(chǎn)纖維素酶。通過對比H/C比值(測量透明圈直徑H和菌落直徑C之比)，初步確定纖維素酶活力的大小，見表1。雖然透明圈的大小直接反映了酶濃度的高低，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力，其原因是多方面的。不同菌株具有不同的生長和產(chǎn)酶速度及不同的纖維素酶系，菌苔大小及在平板上堆積情況的差異等都會造成透明圈大小不同，又固體和液體培養(yǎng)基條件不同，所以液體發(fā)酵復篩必不可少。

2.2 酶活力測定結果

將初篩有染色圈的菌株進一步經(jīng)搖瓶發(fā)酵復篩證明，在檢測平板上，多數(shù)產(chǎn)生較大紅色水解圈的菌株，其發(fā)酵液中酶活力也較高。由表2得出菌株X-02酶活力最高，達182.5 U/mL。不同芽胞桿菌菌株在不同的發(fā)酵條件下測定的纖維素酶活力之間存在著很大的差異，原因是酶的合成受很多因素的影響:首先酶合成受菌體生長速率影響較大，其次酶合成還與誘導物的誘導作用及能量代謝有關。

表1 剛果紅染色法實驗結果Table 1The result of congo red dying methcd

表2 不同芽胞桿菌纖維素酶活力測定結果Table 2Determination of enzyme activing of different bacilli

2.3 發(fā)酵條件的初步優(yōu)化

2.3.1 接種量對X-02產(chǎn)酶的影響采用液體培養(yǎng)基，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，培養(yǎng)48 h后測纖維素酶酶活力，結果見圖1。由圖1可知，接種量為2%時，菌體濃度相對其他接種量較小，但由酶活測定結果可見接種量為2%時培養(yǎng)液中酶活力最高，高于或低于2%接種量酶活力均減少，故最佳接種量為2%。

2.3.2 碳源對X-02產(chǎn)酶的影響改變基礎培養(yǎng)基中碳源的種類和濃度，37℃培養(yǎng)48 h，結果見表3。由表3可見，X-02對碳源利用廣泛，在以糖類物質(zhì)為碳源的培養(yǎng)基中生長較好，且酶活也較高，在淀粉、麩皮中酶活也較高，但對于X-02產(chǎn)生纖維素酶的最佳碳源是CMC-Na，并且以2%濃度的CMC-Na為唯一碳源為最佳?？紤]生產(chǎn)成本和使用方便性(CMC-Na溶解較難)，生產(chǎn)時碳源選擇葡萄糖。

2.3.3 氮源對X-02產(chǎn)酶的影響改變基礎培養(yǎng)基中氮源的種類和濃度，37℃培養(yǎng)48 h，測定酶活力，結果見表3。表3表明，X-02幾乎不能利用無機氮源，在無機氮源的培養(yǎng)基中幾乎不能生長，酶活也很低。其他受試氮源均可作為X-02生長和產(chǎn)酶的氮源，其中以2.0%蛋白胨、酵母膏復合氮源為最優(yōu)。在此復合氮源液體培養(yǎng)基中，X-02生長好，酶活也最高，其酶活可達288.0 U/mL。

表3 不同碳源、氮源對產(chǎn)酶的影響Table 3Effect of various carbrn、nitrogen sources on enzyme formation

2.3.4 培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)酶的影響將芽胞桿菌X-02分別接種于不同初始pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按同樣的發(fā)酵條件發(fā)酵，對產(chǎn)酶情況進行對比，結果見圖2。圖2表明，該菌在pH值為8.0～9.0范圍內(nèi)酶活力較高，pH值為8.0時酶活力達到288.1 U/mL，pH值大于9.0后開始呈下降趨勢，故確定發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為8.0。培養(yǎng)基初始pH值對芽胞桿菌分泌纖維素酶活力影響不同，一方面由于菌種的來源不同，其生長繁殖所要求的pH值也不同另一方面與發(fā)酵時間有關，發(fā)酵時間過長造成培養(yǎng)基pH值變化較大，對酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

2.3.5 不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響發(fā)酵溫度不但對菌種的生長有一定的影響，不同的發(fā)酵溫度對發(fā)酵的結果也產(chǎn)生很大的影響。在測定的最佳pH值條件下采用不同的發(fā)酵溫度(27、32、37、42、47℃)對產(chǎn)酶結果進行優(yōu)化，結果見圖3。由圖3可知，最佳發(fā)酵溫度為37℃，酶活達248.8 U/mL，這一溫度也是該菌株生長的最佳溫度。當高于37℃后酶活力迅速下降。

2.3.6 不同發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響在上述選定的最佳pH值和溫度條件下，對發(fā)酵時間(24、36、48、60、72 h)進行試驗，結果見圖4。由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，在24～36 h呈快速增長趨勢，48 h酶活達到358.4 U/mL，以后逐漸下降。菌種產(chǎn)酶的高峰時間與菌種的生長期有密切關系，一般在菌體生長的對數(shù)期，菌體代謝活動旺盛，分泌胞外酶的活性也最強。

2.3.7 不同轉速對產(chǎn)酶的影響分別采用140、160、180、200和220 r/min的轉速進行產(chǎn)酶試驗，培養(yǎng)24 h后定時取樣，鏡檢觀察菌體生長狀況，并測定發(fā)酵液中的酶活力，結果見圖5。在本實驗條件下，攪拌速度以180 r/min為宜，產(chǎn)酶高峰期在48 h左右出現(xiàn)，纖維素酶酶活力為216.2 U/ mL。降低攪拌速度，將由于溶氧不足而導致菌體生長變慢，產(chǎn)酶的高峰期延后及酶活力下降。160 r/min時酶活力的峰值拖后至60 h左右出現(xiàn)，且最大酶活力比180 r/min時下降了12.1%。當攪拌速度提高到200 r/min，雖然酶活力的峰值提前至36 h出現(xiàn)，但酶的最大活力卻比180 r/min時下降8.9%，這是由于高的轉速引起酶蛋白的變性失活;同時在高轉速情況下，發(fā)酵罐中的泡沫增多，對纖維素酶的合成也不利。

圖1 不同接菌量對產(chǎn)酶的影響Fig.1Effect of quantity of inioculation on eniyme formation

圖2 不同pH值對產(chǎn)酶的影響Fig.2Effect of finitial pH on eniyme formation

圖3 不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.3Effect of temperature on eniyme formation

圖4 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響Fig.4Effect of time on eniyme formation

圖5 不同轉速在不同時間對產(chǎn)酶的影響Fig.5Effect of shaker’s ratating speed on eniyme formation

2.3.8 正交試驗根據(jù)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，設計L9(34)正交試驗。試驗因素及水平見表4，試驗處理及結果見表5。

表4 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基L9(34)正交試驗設計Table 4Design of orthogonal text of fermeated calture L9(34)

表5 X-02優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基L9(34)正交試驗數(shù)據(jù)分析Table 5Analysis of orthogonal test of X-02 fermeated calture L9(34)

從表5可以得出，接種量2%、pH為8、培養(yǎng)溫度為37℃、培養(yǎng)時間為48 h是此芽胞桿菌產(chǎn)酶最佳條件。

2.4 X-02對5種土傳病病原菌的抑菌作用

將5種病原菌的菌懸液加入PDA平板上，用無菌刮爬涂勻，在平皿中間放入無菌牛津杯，然后再在牛津杯中加滿6株芽胞桿菌發(fā)酵液的過濾液，放入28℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d，測量抑菌直徑。結果見表6。從表6可以得到X-02對4種土傳病害病原菌有防治作用。

表6 X-02對5株病原菌的抑制結果Table 6Inhibition of X-02 to 5 pathogenic

3 討論

通過對6株芽胞桿菌產(chǎn)纖維素酶的篩選，發(fā)現(xiàn)菌株X-02酶活性最高(182.5 U/mL)，并進一步對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結果顯示在碳源2% CMC-Na，氮源2.0%蛋白胨及酵母膏復合，在pH值為8.0、溫度37℃、接種量為2%、轉速為180 r/min、時間48 h條件下酶活達到391.0 U/mL，比優(yōu)化前提高了2.1倍，而且該芽胞桿菌對4種土傳病害的病原菌具有抑制作用。由于本實驗未對發(fā)酵培養(yǎng)基組成做精確優(yōu)化，所以有待進一步研究以提高酶的活性，為產(chǎn)酶芽胞桿菌的篩選提供依據(jù)。

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Screening and Enzyme Producing Conditions of Bacillus Strain Inhibited against Soil Borne Pathogen and Produced Cellulase

LIU Xiao-hui，CHEN Shun，CHEN Fei，WANG Hong-qi，HUAN Ming-hui，GAO Xiao-mei，ZHANG Yan，YU Guang-feng，SUN Li-mei，GUO Ling-ling
(Liaoning Acad.of Microbiol.Sci.，Chaoyang 122000)

A Bacillus strain(serial number X-02)was screened among six kinds of Bacillus that excrete extracellular cellulase were screened through DNS spectrophotometer and the Congo red staining，by testing with 5 kinds of pathogen for their inhibition with cup-plate method;and the enzyme activity was as high as 182.5 U/mL and had the inhibition against several soil borne pathogens.Later carbon source，nitrogen source and initial pH of its fermentation medium，temperature，inoculation quantity，rotation of shake flask and time were optimized.The results showed that the best carbon source was 2%CMC-Na，2.0%，the next was glucose，and the difference of the enzyme output was only 21 U/ml，considering the production cost and convenience for large-scale production(slow solubilization of CMC-Na) glucose was chosen as carbon source，and nitrogen source was a compound one of peptone and yeast extract.The enzyme activity was as high as 391.0 U/mL and was 2.1 times as compared with the one before the optimization under the conditions of the pH 8.0，37℃，2%inoculation，180 rpm for 48 h.

cellulase;Bacillus;fermentation;cup-plate method;pathogen

TQ925

A

1005－7021(2011)01－0063－05

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉化項目(國科發(fā)農(nóng)［2010］297號);遼寧省科技廳攻關計劃項目(2009301005)

劉曉輝女，副研究員。現(xiàn)從事微生物研究工作。E-mail:xh194083@sohu.com

2010-08-10;

2010-10-25