李愛學(xué)，孫兆增，尚世臣，王 鵬，姚曉蘭，曾 林

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，北京 100071)

Uncv無毛小鼠無毛基因的分子克隆及序列分析

李愛學(xué)，孫兆增，尚世臣，王 鵬，姚曉蘭，曾 林

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，北京 100071)

目的 探討Uncv無毛小鼠的無毛性狀與無毛基因 (hairless gene，hr)的相關(guān)性。方法 參照Gen-Bank上公布的小鼠的hr序列，設(shè)計(jì)5對引物，用RT-PCR方法對本單位培育的Uncv無毛小鼠hr的編碼區(qū)序列進(jìn)行了克隆與分析。結(jié)果 獲得了Uncv無毛小鼠及野生型hr的全部編碼區(qū)序列 (3546 bp)。Uncv無毛小鼠hr基因與野生型小鼠hr基因的長度及序列完全一致，同源性為100%。與GenBank上發(fā)表的國外小鼠hr基因序列(Z32675)相比，同源性為99.7%，共10個堿基發(fā)生了突變，其中2個堿基突變導(dǎo)致了相應(yīng)的氨基酸突變;和昆明小鼠的hr(AY547391)相比，同源性為99.6%，共12個堿基發(fā)生了突變，其中3個堿基突變導(dǎo)致了相應(yīng)的氨基酸突變;但這些突變是由種屬差異造成的。結(jié)論 Uncv無毛小鼠的無毛性狀產(chǎn)生與hr基因無關(guān)。

Uncv小鼠;無毛基因;分子克隆;序列分析

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Uncv無毛小鼠及BALB/c小鼠各4只，由本中心提供［SCSK(軍)2002-001］。Trizol購自 Invitrogen公司;ReverTra Ace-α-試劑盒為 Toyobo公司產(chǎn)品，DEPC為Promega公司產(chǎn)品;凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自杭州 BioFlux公司;LA-Taq、dNTP、Oligo(dT)、pMD18-T 克隆載體、EcoR Ⅰ及HindⅢ內(nèi)切酶均為大連寶生物公司產(chǎn)品;E.coli DH5α感受態(tài)為北京博邁德公司產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的小鼠無毛基因(hr)序列(GenBank登錄號：Z32675)設(shè)計(jì)5對重疊引物，分別命名為 AF、BF、CF、DF和 EF，引物序列及在無毛基因上的位置見表1，用于擴(kuò)增無毛小鼠及BALB/c小鼠無毛基因的全部編碼區(qū)。因無毛基因編碼區(qū)序列較長(3546 bp)，在其中間位置又設(shè)計(jì)一特異性反轉(zhuǎn)錄引物 TF，序列為：acctgttttctccctgttct(1883-1902)。所有引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

表1 擴(kuò)增無毛基因編碼區(qū)序列所用的引物Tab.1 PCR primers for the amplification of CDS sequence of hr gene

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Uncv無毛小鼠皮膚組織 RNA的提?。喝?只7日齡無毛小鼠，處死后各無菌取200 mg皮膚組織放入用DEPC水處理過的5 mL離心管中，加入適量液氮，用玻棒研磨至粉末狀。加入1 mL Trizol，按Trizol試劑說明書提取總RNA。

1.3.2 Uncv無毛小鼠hr基因的RT-PCR擴(kuò)增：以提取的總RNA為模版，以特異性引物及olig(dT)為反轉(zhuǎn)錄引物，用ReverTra Ace-α-試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件為：42℃ 1 h，95℃ 5 min，4℃ 5 min。然后各以 4 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版，以設(shè)計(jì)的五對DNA序列為引物，用LA Taq進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，以特異性引物的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版擴(kuò)增hr基因的AF和BF段，以 olig(dT)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版擴(kuò)增hr基因的CF、DF、EF段。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃5 min;循環(huán)條件為95℃ 30 s，退火溫度為51～56℃(表 1)，40 s，72℃ 延伸 40 ～ 90 s;最后 72℃ 延伸 7 min。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，并用凝膠回收試劑盒回收基因片段。

1.3.3 Uncv無毛小鼠 hr基因的克隆、鑒定及測序：純化的PCR產(chǎn)物與 pMD18-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取單個白色轉(zhuǎn)化菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過PCR方法和EcoR I和Hind III雙酶切的方法篩選陽性重組子，每個片段各選四個陽性重組子送北京鼎國生物工程公司測序。

1.3.4 BALB/c小鼠hr基因的分子克隆及測序：取4只7日齡BALB/c小鼠，按上述方法同樣提取皮膚組織RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并將陽性重組子測序。

1.3.5 序列分析：利用DNAMAN軟件編輯測序列，將Uncv無毛小鼠的hr基因序列與BALB/c小鼠的hr基因進(jìn)行對比分析，并與GenBank上已公布的國外小鼠和昆明小鼠的hr序列進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 Uncv無毛小鼠皮膚組織總RNA的提取

按照Trizol試劑說明書，成功的從無毛小鼠皮膚組織中提取到總RNA，rRNA的三條帶比較明顯，沒有明顯的降解。結(jié)果如圖1所示。

圖1 無毛小鼠皮膚組織總 RNA的提取結(jié)果(1，2，3，4為四個不同的樣品)Fig.1 The results of total RNA extraction from the skin of Uncv mice(1，2，3，4 represent the four samples).

2.2 無毛小鼠hr基因的RT-PCR擴(kuò)增

以無毛小鼠皮膚組織中提取的總RNA為模版，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后，分別以表1中所列的5對DNA序列為引物，以特異性引物的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版擴(kuò)增hr基因的 AF和 BF段，以 olig(dT)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版擴(kuò)增hr基因的CF、DF、EF段。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度與預(yù)期片段的大小一致(圖2)。

圖2 無毛小鼠hr基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 RT-PCR results of hr gene of Uncv mice

2.3 重組質(zhì)粒的酶切和PCR鑒定

用EcoR I、HindⅢ進(jìn)行重組克隆質(zhì)粒的雙酶切分析，并以重組克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，獲得了無毛小鼠hr基因5個片段的陽性重組質(zhì)粒(圖3)。

圖3 無毛小鼠hr基因5個片段的陽性質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of positive plasmids for the five fragments of hr gene of Uncv mice

2.4 BALB/c小鼠hr基因的分子克隆

以同樣方法對BALB/c小鼠的hr基因進(jìn)行分子克隆，擴(kuò)增得到了BALB/c小鼠hr基因的5個片段(AF－EF)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度與預(yù)期片段的大小一致(圖4)。同樣與 pMD18-T載體連接，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及鑒定后，將陽性重組子送公司測序。

圖4 BALB/c小鼠hr基因的 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 RT-PCR results of hr gene of BALB/c mice.

2.5 序列分析

陽性質(zhì)粒經(jīng)序列測定后，將5個片段的測序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得Uncv無毛小鼠 hr基因的完整編碼區(qū)序列，無毛小鼠的hr基因全長為3546 bp，編碼1182個氨基酸。同樣獲得了 BALB/c小鼠hr基因的全部編碼區(qū)序列，序列分析表明，兩種小鼠hr基因的編碼區(qū)長度及序列完全一致，同源性為100%。Uncv小鼠無毛基因編碼區(qū)序列與GenBank上發(fā)表的國外小鼠無毛基因(Z32675)相比，同源性為99.7%，共有10處不同的地方，分別為：在909和1557位置發(fā)生了G→A突變，在987和3437位置發(fā)生了A→G突變，在1352、1875及2223位置發(fā)生了T→C突變，在1470和1788位置發(fā)生了C→T突變，在2677位置發(fā)生了A→T突變。其中1352位置的突變導(dǎo)致了由異亮氨酸 突變?yōu)樘K氨酸，在3437位置的突變導(dǎo)致了酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼帷Ｆ渌膲A基突變沒有導(dǎo)致氨基酸的變化。與國內(nèi)報(bào)道的昆明小鼠無毛基因(AY547391)相比，同源性為99.6%，共有12處堿基突變，分別是：909、1557位置發(fā)生了G→A突變，987、3437位置發(fā)生了 A→G突變，1236、1352、1875位置發(fā)生了 T→C 突變，1470、1788、2538位置發(fā)生了 C→T突變，1528、2677位置發(fā)生了A→T突變。其中1352位置的突變導(dǎo)致了由異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸，1528位置的突變導(dǎo)致了由蘇氨酸變?yōu)榻z氨酸，3437位置的突變導(dǎo)致了由酪氨酸變?yōu)榘腚装彼帷?/p>

3 討論

無毛基因hr是目前研究較多的、與皮膚和被毛的發(fā)生及結(jié)構(gòu)有重要關(guān)聯(lián)的核受體基因。Cachon-Gonzalez等［6］于1994年首次克隆出小鼠的無毛基因，隨后人［7］、大 鼠［10］、猴［11］等 物 種 的 無毛基因相繼被鑒定。該基因突變會導(dǎo)致毛發(fā)生長調(diào)控的紊亂，誘導(dǎo)毛母質(zhì)細(xì)胞調(diào)亡增多，最終形成毛發(fā)喪失［12］。無毛蛋白主要在毛囊、表皮和腦組織中表達(dá)［13，14］，其確切功能還不太清楚。鑒于無毛基因在皮膚和被毛的發(fā)生及結(jié)構(gòu)中的重要作用，本文通過RT-PCR方法對本單位育成的Uncv無毛小鼠的無毛基因進(jìn)行了分子克隆和序列分析，探討Uncv無毛小鼠的無毛突變與無毛基因hr的相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)獲得的 Uncv無毛小鼠的 hr基因與GenBank上發(fā)表的國外小鼠 hr(Z32675)相比，同源性為99.7%，共有10個堿基發(fā)生了突變，其中2個堿基突變導(dǎo)致了相應(yīng)的氨基酸突變;和國內(nèi)昆明小鼠的 hr基因序列(AY547391)相比，同源性為99.6%，共有12個堿基發(fā)生了突變，其中3個堿基突變導(dǎo)致了相應(yīng)的氨基酸突變;然而，與野生型BALB/c小鼠的hr基因序列相比，長度及序列完全一致，同源性為100%。表明Uncv無毛小鼠與國外小鼠及昆明小鼠的hr基因比較，所發(fā)生的突變是由于種屬差異造成的，這些突變不是導(dǎo)致Uncv無毛小鼠發(fā)生無毛突變的原因，Uncv無毛小鼠的無毛性狀產(chǎn)生與hr基因無關(guān)，其突變機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

［1］ 李善如，仇志華，王冬平.一種新的被毛突變小鼠及其生物學(xué)特性的初步研究［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1995，19：26－28.

［2］ 李善如，王冬平，史燕燕，等.一種新的被毛突變小鼠遺傳特性研究［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1995，15：287－290.

［3］ Jones JM，Elder J，Simin K.Insertional mutation of the hairless locus on mouse chromosome 14［J］.Mamm Genome，1993，4(11)：639 －643.

［4］ Ahmad W，Zlotogorski A，Panteleyev AA，et al..Genomic organization of the human hairless gene and identification of a mutation underlying congenital atrichia in an Arab Palestinian family［J］.Genomics，1999，56(2)：141 －148.

［5］ Panteleyev AA，Paus R，Christiano AM.Patterns of hairless(hr)gene expression in mouse hair follicle morphogenesis and cycling［J］.Am J Pathol，2000，157(4)：1071 － 1079.

［6 ］ Cachón-González M B，F(xiàn)ennner S，et al.Structure and expression of the hairless gene of mice［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91(16)：7717－7721.

［7］ Ahmad W，ul Haque M，Brancolini V，et al.Alopecia universalis associated with a mutation in the human hairless gene［J］.Science，1998，279(5351)：720－724.

［8］ Panteleyev AA，Paus R，Ahmad W，et al.Molecular and functional aspects of the hairless(hr)gene in laboratory rodents and humans［J］.Exp Dermatol，1998，7(5)：249 － 267.

［9］ Zarach J M，Beaudoin GM，Coulombe PA，et al.The co-repressor hairless has a role in epithelial cell differentiation in the skin［J］.Development，2004，131(17)：4189 －4200.

［10］ Thomopson CC.Thyroid hormone-responsive genes in developing cerebellum include a novel synaptotagmin and a hairless homolog［J］.J Neurosci，1996，16(24)：7832 － 7840.

［11］ Ahmad W，Ratterree MS，Panteleyev AA，et al.Atrichia with popular lesions resulting from mutations in the rhesus macaque(Macaca mualtta)hairless gene［J］.Lab Anim-UK，2002，36(1)：61 －67.

［12］ Panteleyev AA，Botchkareva NV，Sundberg JP，et al.The role of the hairless(hr)gene in the regulation of hair follicle catagen transformation［J］.Am J Pathol，1999，155(1)：159 －171.

［13］ Cachón-González MB，San-Jose I，Cano A，et al.The hairless gene of the mouse：relationship of phenotypic effects with expression profile and genotype［J］.Dev Dynam，1999，216(2)：113－126.

［14］ Potter GB，Beaudoin GM III，DeRenzo CL，et al.The hairless gene mutated in congenital hair loss disorders encodes a novel nuclear receptor corepressor［J］.Gene Dev，2001，15(20)：2687 －2701.

Cloning and sequence analysis of hairless gene of Uncv hairless mice

LI Ai-xue，SUN Zhao-zeng，SHANG Shi-chen，WANG Peng，YAO Xiao-lan，ZENG Lin
(Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China)

Objective To explore the correlation of the hairless nature of Uncv hairless mice with the hairless gene(hr).Methods Based on the nucleotide sequence of hr gene of mice published in GenBank，five pairs of primers were designed and the CDS sequence of the hr gene of Uncv mice were cloned by RT-PCR.Result A full-length CDS sequences(3546 bp)of the hr gene of Uncv mice and wide-type BALB/c mice were obtained.The length and sequence of hr gene of Uncv mice were fully consistent with that of BALB/c mice，and the homology was 100%.Compared with the hr gene(Z32675)of mice reported in GenBank，the homology of nucleotide sequence was 99.7%.Ten bases mutated in the hr gene of Uncv mice，and two of them altered the amino acids encoded.Compared with hr gene(AY547391)of Kunming mice，the homology of nucleotide sequence was 99.6%.Twelve bases mutated in the hr gene of Uncv mice，and three of them altered the amino acids encoded.But these mutations were resulted from species differences.Conclusion The hairless nature of Uncv hairless mice is not induced by the mutation of hr gene.

Uncv mice;Hairless gene;Cloning;Sequence analysis

Q95-33，S857.2

A

1005-4847(2011)02-0107-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.005

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心在飼養(yǎng)的BALB/c生產(chǎn)群中偶然發(fā)現(xiàn)一對被毛稀疏的突變鼠［1，2］，其后代出現(xiàn) 3 種表型：全毛、稀毛、無毛。其中無毛小鼠具有毛囊發(fā)育障礙、終生被毛缺失的特征，是研究人的脫發(fā)、斑禿等毛發(fā)疾病的理想模型。該無毛突變被命名為Uncovered，符號為Uncv，該命名已經(jīng)獲得國際遺傳標(biāo)準(zhǔn)化命名國際委員會(ICSGNM)認(rèn)可，并被小鼠基因組數(shù)據(jù)庫(MGD)收錄。

無毛基因(hr)是由于多種無毛小鼠的無毛突變均發(fā)生于該段而得名［3］，是與皮膚和被毛結(jié)構(gòu)有重要關(guān)聯(lián)的核受體基因。它編碼一個潛在的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子［4］，調(diào)控出生后第一次毛發(fā)生長周期的轉(zhuǎn)換，對毛囊細(xì)胞增殖、分化和凋亡的平衡及保持毛乳頭和上皮的完整性具有重要作用［5］。該基因由19個外顯子和18個內(nèi)含子組成，編碼1182個氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量約為127 ×103［6］。人和小鼠的無毛基因突變可導(dǎo)致全部或部分的毛發(fā)喪失［7，8］。無毛基因敲除可導(dǎo)致皮膚脫毛并出現(xiàn)嚴(yán)重的皺褶［9］。鑒于無毛基因在皮膚和被毛的發(fā)生及結(jié)構(gòu)中的重要作用，本文對本單位育成的Uncv無毛小鼠及其野生型小鼠的無毛基因進(jìn)行序列克隆和分析，以期獲得無毛基因的全部編碼區(qū)序列，研究Uncv無毛小鼠無毛性狀產(chǎn)生與無毛基因的關(guān)聯(lián)性。

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(31030058);國家自然科學(xué)基金(30970416);軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心青年基金項(xiàng)目(QN2010-003)。

李愛學(xué)(1978－)女，博士，研究方向：實(shí)驗(yàn)動物學(xué)。Email：lax200178@yahoo.com.cn。

曾林(1965－)男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)與管理。Email：zenglin1965@126.com。

2010-09-15