陳英杰,趙廣高

一氧化氮在一次高負(fù)荷運動誘導(dǎo)大鼠腓腸肌線粒體生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

陳英杰1,趙廣高2

1 前言

研究發(fā)現(xiàn),一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是一種兼有第2信使物質(zhì)和神經(jīng)介質(zhì)功能的新型生物信使,對機(jī)體病理和生理功能起著十分重要的生物學(xué)作用[1]。NO對骨骼肌收縮的調(diào)控是通過多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑完成的,在野生鼠的多種細(xì)胞系中,3個月或是12個月的限制進(jìn)食可以誘發(fā)eNOS的表達(dá)和3’,5’-cGMP的生成[7];培養(yǎng)的細(xì)胞在經(jīng)過 4～6天100 μM的NO供體SNAP處理后,組織中NO含量增加,而且是通過cGMP這個信號通路[26]。同時,一氧化氮供體還可降低離體骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋放,從而抑制骨骼肌收縮[4]。研究表明,在骨骼肌中也存在著NO-NOS-cGMP轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,由于NO的3種亞型在不同肌纖維中的分布不同,而不同強(qiáng)度的運動對不同類型的肌纖維動用也是不一樣。線粒體生物合成是指在一個細(xì)胞的生命周期中線粒體的增殖,是一個由核和線粒體基因共同參與調(diào)控的線粒體系統(tǒng)合成和個體合成的過程[9],各種不同的生理刺激都會激發(fā)線粒體的合成和分解。比如,暴露在冷環(huán)境、運動和限制進(jìn)食等生理刺激都可能誘發(fā)線粒體合成發(fā)生改變[7,8],研究表明,耐力訓(xùn)練能夠提高骨骼肌的呼吸能力,增加線粒體呼吸鏈內(nèi)容物,提高ATP合成酶和代謝所需酶系的含量,為骨骼肌肌的線粒體生物合成提供了強(qiáng)有力的刺激[5]。本研究旨在觀察一次高負(fù)荷運動是否可以促進(jìn)腓腸肌產(chǎn)生NO以及NO在一次性運動誘導(dǎo)的腓腸肌線粒體生物合成中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用如何,并試圖探究其可能的分子機(jī)制。

作者單位:1.阜陽師范學(xué)院體育學(xué)院,安徽阜陽236037;2.南昌大學(xué)體育系,江西南昌330031

2 實驗材料與研究方法

2.1 實驗動物與分組

雄性SD大鼠56只,平均體重為303±16.37 g,由北醫(yī)三院實驗動物中心提供,在本實驗室分籠飼養(yǎng),自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為20℃～25℃,光照12 h/天。實驗將56只 SD大鼠分為安靜對照組(C)、運動后即刻(E0)、運動后3 h(E3)、6 h(E6)、12 h(E12)、18 h(E18)和 24 h(E24)組 ,共計 7 個組 ,每組均為8只,組間體重?zé)o顯著性差異。

2.2 動物運動方式

實驗前,所有動物均未進(jìn)行過跑臺運動。正式訓(xùn)練前,動物先在跑臺上進(jìn)行3天0°,8.2 m/min,10 min/天跑步以適應(yīng)跑臺,再分批進(jìn)行一次性高負(fù)荷跑臺運動。跑臺為中國產(chǎn)6跑道小動物跑臺。采用Bedford據(jù)大鼠體重/攝氧量回歸方程所建立的遞增運動負(fù)荷訓(xùn)練大鼠模型[3]。按以下運動程序運動至90 min:第1級負(fù)荷:0°,8.2 m/min,15 min(相當(dāng)于53%˙VO2max);第2級負(fù)荷:5°,15 m/min,15 min(相當(dāng)于64%˙VO2max);第3級負(fù)荷:10°,19.3 m/min(相當(dāng)于76%˙VO2max)運動至90 min。大鼠在運動過程中,經(jīng)驅(qū)趕不能再堅持運動時,使其休息2 min后,繼續(xù)按上述要求進(jìn)行運動,如此反復(fù)運動,直到運動時間累計達(dá)到90 min,停止運動。分別選取實驗動物安靜時、運動后即刻、運動后3 h、6 h、12 h、18 h和 24 h,共 7個實驗觀察點。

2.3 動物組織的提取

所有組別的動物均以1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,在無任何反射反應(yīng)后,迅速取出腓腸肌,液氮速凍,之后于-70℃凍存。

2.4 一氧化氮(NO)濃度的測定

使用南京建成生物工程研究所的試劑盒,所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。NO濃度采用硝酸還原酶法測定,單位為μmol/g組織蛋白(μmol/g prot)。組織蛋白質(zhì)濃度用考馬斯亮藍(lán)法測定[21]。樣品前處理:取約0.1 g腓腸肌,加入900μl的生理鹽水,用手動勻漿器制備成10%的勻漿,離心取上清液測定NO濃度和NOS活性。

2.5 一氧化氮合酶(NOS)活性的測定

使用南京建成生物工程研究所的試劑盒,所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。NOS活性是通過測定單位重量組織蛋白質(zhì)在單位時間內(nèi)生成NO的nmol數(shù)來測定,其活性單位的定義為:每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol NO為一個酶活力單位,單位為U/mg組織蛋白(U/mg prot)。

2.6 環(huán)一磷酸鳥苷(cGMP)含量的測定

使用上海中醫(yī)藥大學(xué)核醫(yī)學(xué)實驗室的試劑盒,所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書講行。cGMP含量采用放射免疫法測定,單位為pmol/ml組織蛋白。

2.7 RT-PCR測定線粒體生物合成相關(guān)基因的測定

采用RT-PCR法測線粒體生物合成相關(guān)基因表達(dá):

1.Trizol Reagent抽提總RNA;

2.測定總RNA純度和完整性:將3μlRNA于0.8%的瓊脂糖上進(jìn)行電泳,經(jīng)凝膠成像儀分析,如28 s、18 s、5 s 3條帶清晰可見,RNA可用于逆轉(zhuǎn)錄。同時,在紫外分光光度計上測260/280值,計算 RNA含量,在比值大于等于1.70時,RNA可用于逆轉(zhuǎn)錄;

3.逆轉(zhuǎn)錄:采用Revert Aid First Stand cDNA Synthesis kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),所有操作均嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書講行;

4.PCR反應(yīng):1)引物序列及產(chǎn)物長度(表1);2)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系組成:按照SYBR○RPremix Ex Taq TM Kit(TaKaRa)說明書配制反應(yīng)體系;3)溫度循環(huán)參數(shù):actin:預(yù) 變 性 95℃/1min;95℃/15s,55℃/15s,72℃/15s,共40cycles。eNOS:預(yù)變性 95℃/1min;95℃/15s,55℃/15s,72℃/15s,共40cycles;4)圖像分析:目的基因的相對量為:Fold Change=2- Δ(ΔCT);ΔCT=CT target-CT actin;Δ(ΔCT)=ΔCT target-ΔCT control;PGC-1α:預(yù)變性 95 ℃/1min;95℃/15s,57℃/15s,72℃/15s,共40cycles。NRF-1:預(yù)變性95℃/1min;95℃/15s,58℃/15s,72℃/15s,共40cycles。Tfam:預(yù)變性 95℃/1min;95℃/15s,57℃/15s,72℃/15s,共40cycles。COXIV:預(yù)變性 95℃/1min;95℃/15s,59℃/15s,72 ℃/15s,共 40cycles。

5.圖像分析:目的基因的相對量為:Fold Change=2-Δ(ΔCT);ΔCT=CT target-CT actin;Δ(ΔCT)=ΔCT target-ΔCT control。

2.8 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 一次高負(fù)荷運動后腓腸肌NO濃度、NOS活性、NOS基因表達(dá)和cGMP含量的變化結(jié)果

一次高負(fù)荷運動后,與安靜對照組相比,運動后即刻(E0)腓腸肌NO濃度略有升高。在恢復(fù)期,NO濃度基本維持在同一水平;運動后即刻(E0)腓腸肌NOS活性顯著增加(P＜0.01),隨后降低,在運動后 6 h(E6)達(dá)到峰值(P＜0.01),然后下降,在運動后24 h(E24)已基本恢復(fù)到安靜水平;一次性運動后即刻(E0)腓腸肌eNOS mRNA表達(dá)顯著下降(P＜0.01),隨后逐漸回升,在運動后6 h(E6)達(dá)到峰值,然后緩慢下降。一次性運動后即刻腓腸肌cGMP含量顯著升高,在運動后6 h(E6)達(dá)到峰值(表2)。

表1 PCR引物一覽表Table 1 Oligonuclcotide Primers Used in the PCR Amplification

表2 一次高負(fù)荷運動后大鼠腓腸肌NO濃度、NOS活性eNOS mRNA和cGMP含量以及腓腸肌線粒體生物合成的轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)、核編碼的線粒體基因COXIV基因和蛋白表達(dá)的變化一覽表Table 2 The Changes of G astrocnemius NO、NOS activity、eNOS mRNA 、cGMP Content、PGC-1αmRNA、NRF-1 mRNA、Tfam mRNA、COXIV mRNA and COXIV Protein after a High-intensity Exercise

3.2 一次高負(fù)荷運動后大鼠腓腸肌線粒體生物合成的轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)的變化結(jié)果

一次高負(fù)荷運動后即刻(E0)大鼠腓腸肌線粒體轉(zhuǎn)錄因子 PGC-1αmRNA顯著升高(P＜0.01),隨后繼續(xù)升高,PGC-1αmRNA的表達(dá)在運動后3 h(E3)達(dá)到峰值(P＜0.01),運動后即刻(E0)大鼠腓腸肌線粒體轉(zhuǎn)錄因子NRF-1 mRNA、Tfam mRNA的表達(dá)都升高,隨后繼續(xù)升高,NRF-1 mRNA、Tfam mRNA的表達(dá)在運動后6 h(E6)達(dá)到峰值(P＜0.01),然后都緩慢下降(表2)。

3.3 一次高負(fù)荷運動后大鼠腓腸肌線粒體生物合成的核編碼線粒體基因COXIV基因和蛋白表達(dá)的變化結(jié)果

一次高負(fù)荷運動后即刻(E0)大鼠腓腸肌核編碼的線粒體基因COXIV mRNA表達(dá)逐步升高,在運動后12 h和18 h保持較高水平(P＜0.01),然后下降;而一次高負(fù)荷運動后即刻COXIV蛋白含量略有下降,在恢復(fù)期中,COXIV含量逐步上調(diào),在運動后12 h(E12)達(dá)到峰值,但沒有顯著性差異(表2)。

4 討論與分析

4.1 一次高負(fù)荷運動后腓腸肌NO濃度、NOS活性、NOS基因表達(dá)及NO-NOS-cGMP轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化的分析

NO是近些年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的細(xì)胞內(nèi)信使,在骨骼肌系統(tǒng)中可能發(fā)揮著信息傳遞作用。NO可由L-精氨酸經(jīng)NOS的催化作用而產(chǎn)生,NO激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC),使細(xì)胞內(nèi)cGMP含量增加,cGMP又作為細(xì)胞內(nèi)第2信使,通過調(diào)控離子通道、調(diào)節(jié)磷酸二酯酶(PDE)的活性、激活eGMP依賴的蛋白激酶(GPK)和與cAMP依賴的蛋白激酶(PKA)的交互作用,而引發(fā)細(xì)胞一系列的級聯(lián)反應(yīng),發(fā)揮信息傳遞作用[2]。運動訓(xùn)練對NOS的影響隨運動強(qiáng)度和時間的不同而不同。短時間運動后即可激活內(nèi)皮細(xì)胞與骨骼肌的NOS活性,增加NO的生成;而持久鍛煉則能使NOS mRNA的表達(dá)上調(diào),提高NOS的數(shù)量,從而增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞和骨骼肌產(chǎn)生NO的能力。John等認(rèn)為,運動引起NO升高的原因可能是由于運動訓(xùn)練使NOS mRNA表達(dá)上調(diào),NO生成增加[25]。Shen和Sessa分別對狗進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),長期運動訓(xùn)練使NOS基因表達(dá)上調(diào)[17]。長期高強(qiáng)度訓(xùn)練后恢復(fù)期骨骼肌內(nèi)iNOS活性增高[1]。Robers等[18]發(fā)現(xiàn),大鼠在45min跑臺運動后即刻NOS活性提高了37%,可能是由于運動中細(xì)胞內(nèi)Ca2+依賴性的cNOS(結(jié)構(gòu)型NOS)所致。有實驗表明,一次性運動后即刻腓腸肌NOS活性顯著提高,同時,伴隨肌糖原濃度的下調(diào),經(jīng)過L-NAME(NO抑制劑)處理后,

運動后即刻NOS活性則顯著降低[19]。然而,關(guān)于運動后機(jī)體NO含量和NOS活性的變化,目前研究結(jié)果不盡相同,多數(shù)研究支持運動后機(jī)體NO含量和NOS活性明顯升高。本實驗發(fā)現(xiàn),大鼠運動后即刻,骨骼肌NO濃度有所升高,NOS活性顯著提高,而eNOS mRNA的表達(dá)卻顯著下調(diào)。這與以往的研究結(jié)論基本相似。同樣有實驗發(fā)現(xiàn),以運動強(qiáng)度為78%˙VO2max運動的大鼠,力竭即刻其心肌cNOS mRNA和蛋白水平下調(diào)[14],但其原因尚不明確。本實驗觀察到,骨骼肌NO濃度沒有明顯的變化;NOS活性在運動后6 h達(dá)到峰值,隨后下降,24 h時已基本回落到安靜水平;eNOS mRNA表達(dá)量也在運動后6h達(dá)到最高,隨后降低。這說明,一次高強(qiáng)度運動激活骨骼肌NOS活性和NOS mRNA的表達(dá),而且是一過性的表達(dá)上調(diào),從而增加了骨骼肌內(nèi)NO的水平。我們認(rèn)為,一次高負(fù)荷運動可以調(diào)控骨骼肌eNOS表達(dá)。

NO對骨骼肌收縮的調(diào)控是通過多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑完成的,在心肌和平滑肌中,NO的作用主要是通過作為“第二信使”的cGMP來介導(dǎo)的。在骨骼肌中也存在著 NO-NOS-cGMP轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其通路如圖1所示[20]。NO供體可以使cGMP濃度升高,阻斷 NOS則可降低cGMP含量。至于NO-NOS-cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作用的靶目標(biāo)至今尚未確定。

本實驗結(jié)果可以看出,一次高負(fù)荷運動顯著提高了腓腸肌中cGMP含量,其中,運動后6h達(dá)到最高值,運動后24 h才恢復(fù)接近安靜對照值。由此說明,運動促進(jìn)了大鼠腓腸肌cGMP的產(chǎn)生。一次高負(fù)荷跑臺運動后,腓腸肌NOS活性和eNOS mRNA表達(dá)在運動后6 h出現(xiàn)峰值,腓腸肌cGMP含量也在運動后 6h其含量最高。從整體上講,腓腸肌cGMP的變化規(guī)律與腓腸肌NOS活性和eNOS mRNA表達(dá)的變化基本一致,證實可能存在腓腸肌中NO-NOS-cGMP通路激活參與調(diào)控NO體系。

圖1 NO-NOS-cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路示意圖Figure 1. NO-NOS-cGMP Signalling Pathw ays

4.2 一次高負(fù)荷運動后腓腸肌線粒體生物合成相關(guān)基因表達(dá)和蛋白含量變化分析

線粒體是細(xì)胞能量代謝的主要場所,產(chǎn)生大量的ATP滿足正常生理功能的需要。線粒體已不再被認(rèn)為是靜止的細(xì)胞器,而是在細(xì)胞中時刻運動的,不斷發(fā)生著融合和分裂[15]。線粒體生物合成是指在一個細(xì)胞的生命周期中線粒體的增殖,以及線粒體的系統(tǒng)合成和個體合成的過程,是一個由核和線粒體基因共同參與調(diào)控的過程。由核基因編碼的線粒體生物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有:PGC-1α、NRF-1、NRF-2、Tfam等。在這些調(diào)控因子中,PGC-1α(過氧化物酶增殖激活受體γ-輔助激活因子-1α)是至關(guān)重要的一個。PGC-1α可以促進(jìn)NRF-1(核呼吸因子1)和 NRF-2(核呼吸因子2)的表達(dá),激發(fā)參與mtDNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的核編碼的基因表達(dá)[22]。實驗證實,PGC-1α高表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量增加,并伴隨核基因 NRF-1、NRF-2、Tfam、UCP-2及線粒體基因COX亞基的高表達(dá)[27]。

圖2 線粒體轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控示意圖Figure 1. The Mitochondrial Transcription Factors Control Schemes

目前的研究普遍公認(rèn),PGC-1α通過刺激 NRF-1和NRF-2,然后激活 Tfam,Tfam表達(dá)后被運輸?shù)骄€粒體內(nèi),與其啟動子位點相結(jié)合,增加線粒體編碼的基因表達(dá),通過以上途徑激活核和線粒體內(nèi)表達(dá)線粒體蛋白的基因,從而促進(jìn)線粒體的生物合成(圖1)[6]。

一次性運動或電刺激均可以誘發(fā)骨骼肌中PGC-1αmRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)[10-12,24]。一次運動后18h,骨骼肌PGC-1αmRNA和蛋白的表達(dá)量上升大約2倍,NRF-1和NRF-2的表達(dá)也顯著上調(diào)[13]。Pilegaard等人的研究發(fā)現(xiàn),運動后恢復(fù)期,人骨骼肌中由運動誘導(dǎo)出的 PGC-1α的轉(zhuǎn)錄水平明顯提高[16]。本實驗結(jié)果顯示,大鼠經(jīng)過一次大強(qiáng)度的跑臺運動,運動后即刻腓腸肌中PGC-1αmRNA表達(dá)顯著升高,NRF-1、Tfam和COXIV mRNA的表達(dá)也有升高的趨勢,而腓腸肌COXIV蛋白含量略有下調(diào)的趨勢。在恢復(fù)期,這些轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)會繼續(xù)上調(diào),PGC-1α的表達(dá)在運動后3h達(dá)到峰值,NRF-1和 Tfam的表達(dá)分別在運動后6h達(dá)到最高,COXIV的表達(dá)在運動后18h達(dá)到峰值。這些結(jié)果與大部分文獻(xiàn)報道基本相符。Takayuki的實驗發(fā)現(xiàn)一次跑臺運動后3h,小鼠腓腸肌PGC-1αmRNA含量會有一過性的顯著上調(diào)[23]。從實驗結(jié)果看,我們認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子出現(xiàn)峰值存在著前后順序,而且運動可以誘導(dǎo)它們一過性的表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步驗證了線粒體生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑,即PGC-1α首先會刺激NRF-1和NRF-2,然后激活 Tfam,Tfam表達(dá)后被運輸?shù)骄€粒體內(nèi),與其啟動子位點結(jié)合,發(fā)揮作用。

運動促進(jìn)NRF-1與Cyt-c、NRF-2與COXIV啟動子的結(jié)合,以及Cytc、ALAS和檸檬酸合成酶mRNA表達(dá)的上調(diào)要先于PGC-1α的表達(dá),而半衰期較短的線粒體蛋白的表達(dá)上調(diào)可能會與 PGC-1α蛋白的上調(diào)同步[12]。我們實驗發(fā)現(xiàn)運動后3h腓腸肌 PGC-1αmRNA表達(dá)最高,而其蛋白含量在運動后12h達(dá)到峰值?；虻谋磉_(dá)與蛋白含量之間不同步,蛋白的變化要滯后于 mRNA的變化。然而,腓腸肌NRF-1和Tfam的mRNA表達(dá)在運動后3h就開始顯著上調(diào),6h時達(dá)到峰值。這間接提示,誘導(dǎo)腓腸肌 NRF-1和Tfam表達(dá)的不一定是 PGC-1αmRNA的上調(diào),而可能是PGC-1α活性的增加先于mRNA作用于后續(xù)的線粒體轉(zhuǎn)錄因子,但這一推論尚不確定。

5 結(jié)論

1.一次高負(fù)荷運動會一過性地上調(diào)骨骼肌NOS活性和NOS mRNA的表達(dá),進(jìn)而增加骨骼肌內(nèi)NO的水平,可能存在腓腸肌中 NO-NOS-cGMP通路激活參與調(diào)控 NO體系。

2.一次高負(fù)荷運動會促進(jìn)腓腸肌線粒體轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α、NRF-1和 Tfam的mRNA表達(dá),以及由核編碼的線粒體蛋白COXIV的mRNA和蛋白的水平也出現(xiàn)一過性的上調(diào)。

3.NO通過sGC-cGMP依賴信號途徑激活一次高負(fù)荷運動腓腸肌線粒體PGC-1α,進(jìn)而激發(fā)線粒體生物合成。

[1]黨曉云,張建,梁芝棟.NO及其生成調(diào)節(jié)與運動[J],河南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2009,37(2):132-134.

[2]范宏剛,盧德章,胡魁,等.替來他明對大鼠不同腦區(qū)NO-cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的影響[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2008,(10):904-908.

[3]史紹蓉,王娟.α-心肌肌球蛋白重鏈與原肌球蛋白-1在不同負(fù)荷運動中的差異表達(dá)研究[J].北京體育大學(xué)學(xué)報,2009,32(10):51-54.

[4]鐘慈聲,孫安陽.一氧化氮的生物醫(yī)學(xué)[M].上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1997:3-39.

[5]BOOTH FW,THOMASON DB.Molecular and cellular adaptation of muscle in response to exercise:perspectives of various models[J].Pysiol Rev,1991,71:541-585.

[6]DANIEL PK,RICHARD CS.Transcriptional regulatory circuits controlling mitochondrial biogenesis and function[J].Gene&Development,2004,(18):357-368.

[7]ENZO N,CRISTINA T,Annalisa C,et al.Calorie restriction promotes mitochondrial biogenesis by inducing the expression of eNOS[J].Science,2005,310:314-317.

[8]ENZO N,EMILIO C,CLARA P,et al.Mitochondrial biogenisis in mammals:The role of endogenous nitric oxide[J].Science,2003,299:896-899.

[9]GARESSE R,VALLEJO C G.Animal mitochondrial biogenesis and function:A regulatory cross-talk between two genomes[J].Gene,2001,263(1-2):1-16.

[10]GOTO M,TERADA S,KATO M,et al.cDNA cloning and mRNA analysis of PGC-1 in epitrochlearis muscle in swimming-exercised rats[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,274:350-354.

[11]HENRIETTE P,BENGT S P,DARRELL N.Exercise induces transient transcriptional activation of the PGC-1αgene in human skeletal muscle[J].J Physiol,2003,546:851-858.

[12]ISABELLA I,PETER JA,TREACEY S,et al.PPARγcoactivator-1αexpression during thyoid hormone and contractile activity-induced mitochondrial adaptations[J].Am JPhysiol,2003,284:C1669-C1677.

[13]KEITH B,ADAM RW,TERRY EJ,et al.Adaptation of skeletal muscle to exercise:rapid increase in the transcriptional coactivator PGC-1[J].FASEB,2002,16:1879-1885.

[14]MOTOYU KI E,TAKASHI M,SEIJ I M,et al.Intense exercise causes decreases in expression of both endothelial NO synthase and tissue Nox level in hearts[J].Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol,2000,279(3):R951-R959.

[15]NEUPERT W.Protein import into mitochondria[J].Annu.Rev.Biochem,1997,66:863-917.

[16]PILEGAARD H,SAL TIN B,NEUFER P D.Exercise induces transient transcriptional activation of the PGC-1alpha gene in human skeletal muscle[J].J Physiol,2003,546:851-858.

[17]PRINCE R G,GUNSON D E.Rising interest in nitric oxide synthase[J].TIPS,1993,18(2):35-36.

[18]ROBERS C K,JANA R,PER A,et al.Differential expression of nitric oxide synases(NOS 1-3)in rats skeletal muscle following exercise[J].FASEB J,2004,10:1096-1099.

[19]ROBERS C K,BAMARD R J,JASMAN A,et al.Acute exercise increases nitric oxide synthase activity in skeletal muscle[J].Am J Physiol,1999,277:E390-E394.

[20]SALVADOR M,JORGED E.Does nitric oxide modulate mitochondrial energy generation and apoptosis[J].Nature,2002,(3):214-220.

[21]SAMBROOKJ,FRITSCH EF.分子克隆實驗指南(第2版)[M].金冬雁,黎孟楓等譯.北京:科學(xué)出版社,1995.

[22]SCAPULLA R C.Nuclear activators and coactivators in mammalian mitochondrial biogenesis[J].Biochem Biophys Acta,2002,1576:1-14.

[23]TAKAJ YU KI A,STEVEN T C P,PING L,et al.Exercise stimulates PGC-1αtranscription in skeletal muscle through activation of the p38MAPKpathway[J].J Biol Chem,2005,280:19587-19593.

[24]TERADA S,GOTO M,KATO M,et al.Effects of low-intensity prolonged exercise on PGC-1 mRNA expression in rat epitrochlearis muscle[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,296(2):350-354.

[25]XU DL,MARTIN PY,JOHN ST,et al.Upregulation of endothelial and neuronal constitutive nitric oxide synthase in pregnant rats[J].AmJ Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol,1996,271:1739.

[26]WANG S,YAN L,WESLEY R A,et al.Nitric oxide increases tumor necrosis factor production in differntiated U937 cells by decreasing cyclic AMP[J].J Biol Chem,1997,272:5959-5965.

[27]WU Z,PUIGSERVER P,ANDENSSON U,et al.Mechansms controlling mitochondrial biogenesis and respiration through the thermogenic coactivator PGC-1[J].Cell,1999,98:115-124.

NO Effects of Transcriptional the Regulation of Rat G astrocnemius Mitochondria Biosynthesis after a High-load Exercise

CHEN Ying-jie1,ZHAO Guang-gao2

目的:觀察一次高負(fù)荷運動后NO介導(dǎo)腓腸肌線粒體生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。方法:6周齡雄性SD大鼠56只,隨機(jī)分成:安靜對照組(C)、運動后即刻組(E0)、運動后3 h組(E3)、6 h組(E6)、12 h組(E12)、18 h組(E18)和 24 h組(E24);硝酸還原酶法測腓腸肌NO濃度和 NOS活性,放射性免疫法測 cGMP含量;RT-PCR測eNOS、PGC-1α、NRF-1、Tfam和COXIV基因;Western-blotting測COXIV蛋白。結(jié)果:E0組腓腸肌NO濃度、cGMP含量升高,NOS活性增加,eNOS mRNA下降;E6組NOS活性、eNOS mRNA和cGMP含量都達(dá)到峰值。E0組腓腸肌NRF-1mRNA、Tfam mRNA、PGC-1α和 COXIV mRNA升高。結(jié)論:一次高負(fù)荷運動可能通過NO-NOS-cGMP通路激活、調(diào)控NO體系,進(jìn)而激活 sGC-cGMP依賴信號途徑,激發(fā)線粒體生物合成。

高負(fù)荷運動;腓腸肌;一氧化氮;環(huán)一磷酸鳥苷;線粒體;生物合成;鼠;動物實驗

Objective:To observe the variation of gastrocnemius muscle NO-NOS-Cgmp pathway and NO effects the gastrocnemius muscle transcriptional regulation of mitochondrial biogenesis after a high-load exercise.Methods:56 male SD rats(6-week-old)randomly divided into quiet control group(C),0-hour after treadmill exercise group(E0),3 h(E3),6 h(E6),12 h(E12),18 h(E18)and 24 h(E24)group.Determinate gastrocnemius muscle NO concentration and NOS activity through the method of nitrate reductase,determinate gastrocnemius muscle cGMP content through the method of radioimmunoassay;determinate gastrocnemius muscle eNOS mRNA,PGC-1αmRNA,NRF-1 Mrna,Tfam mRNA and COXIV mRNA expression through the method of RT-PCR;determinate gastrocnemius muscle COXIV protein content by Western-Blotting method.Results:E0 group gastrocnemius muscle NO concentration,cGMP content and NOS activity was increased,eNOS mRNA was decreased,E6 group NOS activity,eNOS mRNA and cGMP content all reached the peak.E0 group gastrocnemius muscle NRF-1mRNA,Tfam mRNA,PGC-1αmRNA and COXIVmRNA was increased.Conclusion:A highload exercise can regulate gastrocnemius muscle NO system with its NO-NOS-cGMP pathway,and NO activate sGC-cGMP signaling pathway,thus inspire mitochondrial biogenesis.

high-load exercise;gastrocnemius;NO;cGM P;mitochondria;biosynthesis

G804.7

A

1000-677X(2011)03-0058-05

2010-10-08;

2011-02-15

陳英杰(1972-),男,江蘇連云港人,副教授,碩士,主要研究方向為運動人體科學(xué),Tel:(0558)2591812,E-mail:fysfxycyj@sina.com;趙廣高(1982-),男,河南周口人,助教,碩士,主要研究方向為運動人體科學(xué),Tel:(0791)6990921,E-mail:haogg2002@163.com。

Fuyang Teacher College,Fuyan 236037,China;Nanchang University,Nanchang 330031,China.