李東君,賈全章*,陳玉丙,孫景海,吳傳真,王風(fēng)華,徐 爽,劉麗萍,姜大偉,高德萱

(1.解放軍第208醫(yī)院,吉林 長春130062;2.吉林大學(xué)附屬第二醫(yī)院,吉林 長春130041)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem cells,BMSCs)具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能,在特定的誘導(dǎo)環(huán)境條件下可以向骨、心肌、神經(jīng)元等多胚層方向分化[1-4]。細(xì)胞凋亡是脊髓繼發(fā)性損傷的重要形式之一,受多種凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控[5]。有研究報(bào)道BMSCs移植能改善脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能[6,7]。本實(shí)驗(yàn)探討B(tài)MSCs移植對脊髓損傷大鼠凋亡調(diào)控蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)Wistar大鼠120只,雌性,體重(260±20)g,隨機(jī)分為4組各30只:對照1、2組,治療1組、2組。出生5天的Wistar乳鼠(8.0-10.0 g)5只。均購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要儀器與試劑 MC01751IF型CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO);FACScan流式細(xì)胞儀(美國BD公司);DMEM 培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(美國Hyclone公司);兔抗鼠CD34熒光直標(biāo)抗體(美國BD公司),激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司),濃縮型DAB試劑盒(北京中山)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 BMSCs的提取、分離、培養(yǎng) Wistar乳鼠5只,頸椎脫臼法處死,無菌下取股骨和脛骨的骨髓細(xì)胞,采用貼壁篩選法結(jié)合差速貼壁法分離、純化BMSCs,貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng),原代培養(yǎng)后按1∶3比例傳代共3代。

1.3.2 BMSCs的鑒定 每次傳代后行形態(tài)學(xué)觀察,并測定表面標(biāo)志物的表達(dá)以鑒定細(xì)胞。

(1)BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 使用倒置相差顯微鏡逐日觀察原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞,記錄細(xì)胞生長、增殖情況及形態(tài)特征。

(2)細(xì)胞表面分子表型檢測進(jìn)行FACS檢測分析。細(xì)胞表面標(biāo)志MHC-Ⅰ、Ⅱ常規(guī)切片(片厚5 μ m),光鏡下觀察。

1.3.3 脊髓損傷模型的建立 實(shí)驗(yàn)組采用改良的Allen's打擊法建立脊髓損傷模型,術(shù)后常規(guī)方法籠內(nèi)飼養(yǎng)護(hù)理。

1.3.4 BMSCs的移植方法

(1)治療1組采用靜脈回輸治療 于建模當(dāng)天行BMSCs移植,用0.3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔麻醉,1 ml注射器作尾靜脈穿刺,緩?fù)谱舛葹?×106個(gè)/ml的MSCs 1 ml,連續(xù)注射兩天。

(2)治療2組采用局部移植治療 于建模后縫合前用微量注射器約45度斜角將BMSCs細(xì)胞懸液沿后中央溝緩慢注人到脊髓損傷區(qū)頭側(cè)和尾側(cè)損傷臨近區(qū)域的灰白質(zhì)交界處(距脊髓表面約1mm)共2點(diǎn),每點(diǎn)5μ l,濃度為4×107/ml,留針5分鐘,醫(yī)用生物蛋白膠封閉注射孔。

1.3.5 免疫組化染色法檢測各組Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá) 按試劑盒說明書操作。

每組制作每種切片各6張,每張切片于40×10倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野,mIgae-or-Plus生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析,在40×10倍鏡下對凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax和Bcl-2的免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量的分析,計(jì)算平均灰度值。結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用SPSS13.0軟件包處理數(shù)據(jù),用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征 轉(zhuǎn)種至塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)的原代細(xì)胞經(jīng)換液后,即可見呈單個(gè)分散或幾個(gè)細(xì)胞克隆的貼壁細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)較均勻,呈多邊形,立體感較強(qiáng)(圖1.A)。7天后,懸浮細(xì)胞、圓形血細(xì)胞明顯減少,少量梭形或紡錘樣細(xì)胞開始出現(xiàn)(圖1.B)。根據(jù)生長情況每4-7天進(jìn)行一次傳代,傳代培養(yǎng)3代時(shí),細(xì)胞形態(tài)變得較為一致,絕大部分為細(xì)長梭形細(xì)胞,也有扁平形帶突起的細(xì)胞,似成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞可散在生長,有明顯的梭形細(xì)胞集落呈克隆樣生長(圖1.C)。觀察表明,體外分離的BMSCs得到了進(jìn)一步的純化及擴(kuò)增。

圖1 Wistar大鼠BMSCs培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征(×100)

2.2 BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá) 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見圖2,三代BMSCs基本不表達(dá)CD34、CD45,表達(dá)CD44。光鏡下見三代BMSCs基本不表達(dá)MHC-Ⅱ ,表達(dá)MHC-Ⅰ(圖3)。

圖2 流式細(xì)胞儀測定BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)

圖3 光鏡下BMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)(×200)

2.3 BMSCs對模型大鼠脊髓損傷區(qū) Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響 結(jié)果見表1、圖4。

3 討論

神經(jīng)細(xì)胞的凋亡在脊髓損傷中占重要地位,脊髓損傷后不但存在急性期的細(xì)胞壞死,也存在亞急性的細(xì)胞凋亡。Emery等[8]首先證實(shí)了在人類創(chuàng)傷性脊髓損傷后存在細(xì)胞凋亡。此后,對嚙齒類動(dòng)物脊髓損傷模型的研究也證實(shí)了細(xì)胞凋亡在脊髓損傷中的作用[9]。Li等[10]的研究發(fā)現(xiàn)SCI后長纖維束軸突表達(dá)Bcl-2,但凋亡的少突膠質(zhì)細(xì)胞未見Bcl-2的上調(diào)。在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)過程中,通常認(rèn)為Bcl-2作用于Caspase-3的上游,通過抑制Caspase-3激活而發(fā)揮作用。

表1 各組術(shù)后損傷區(qū)Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)

圖4 各組不同時(shí)間點(diǎn)凋亡調(diào)控蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3)的表達(dá)(DAB,×100)

Caspases家族對細(xì)胞,特別是神經(jīng)元凋亡程序的啟動(dòng)具有核心作用。它直接水解激活與DNA斷裂等凋亡特征性改變密切相關(guān)的蛋白,又稱為死亡蛋白酶。迄今已發(fā)現(xiàn)14個(gè)家族成員,其中Caspases-3是凋亡過程中最重要的蛋白酶,是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分,是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[11]。Bcl-2家族已有成員達(dá)15種之多,包括凋亡抑制基因(Bcl-2,bcl-XI等)和促進(jìn)凋亡基因(Bax,Bac等),它們共同組成一個(gè)細(xì)胞凋亡調(diào)控體系,在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),脊髓損傷后Bcl-2蛋白僅有少量表達(dá),而Bax蛋白大量表達(dá)。說明脊髓損傷后促進(jìn)凋亡因子占優(yōu)勢,而保護(hù)因子不足從而使神經(jīng)細(xì)胞向凋亡相關(guān)基因的表達(dá),如何調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá),對保護(hù)神經(jīng)元也具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn),通過靜脈或局部移植的BMSCs,在不同時(shí)間點(diǎn)可不同程度的上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),下調(diào)Caspase-3、Bax表達(dá),具有抗凋亡作用。兩移植組間因處理因素不同,無比較意義。細(xì)胞凋亡是一很復(fù)雜的機(jī)制,涉及許多基因的調(diào)控及眾多凋亡因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,因此BMSCs對細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制還需通過基因及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等角度進(jìn)行更深層次的研究以闡明其機(jī)理。進(jìn)一步研究凋亡發(fā)生的調(diào)控機(jī)制并利用細(xì)胞凋亡規(guī)律有效地調(diào)控細(xì)胞凋亡是治療脊髓損傷的新思路、新途徑。而通過不同方法移植BMSCs獲得陽性結(jié)果也為其在臨床應(yīng)用上奠定了基礎(chǔ)。

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