方 芳,邢 影,徐忠信,鄭昭石,張 爽

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,吉林長春130033)

酸敏感離子通道是一類位于細(xì)胞膜上的陽離子通道,近年來有研究已經(jīng)表明在腦缺血的過程中伴有酸敏感離子通道的激活[1]。引起酸敏感離子通道激活的原因主要由于細(xì)胞外的pH值的降低,而酸中毒是腦缺血發(fā)病過程中的主要病理機(jī)制。本研究在前期實驗中已經(jīng)證實糖尿病合并的局灶腦缺血氧化應(yīng)激反應(yīng)較單純腦缺血時明顯增強(qiáng),而Xiang-Ping Chu[2]等人的研究發(fā)現(xiàn)ASIC1a的胞外段有氧化及還原結(jié)合位點,因此我們推測在糖尿病局灶腦缺血時可能伴有ASIC1a開放的增加。為了驗證此假說并觀察其在不同缺血時間時的變化規(guī)律,我們進(jìn)行如下實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、分組及主要試劑、儀器

雄性Wistar大鼠72只,體重在220-240 g(由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供)。

分組:糖尿病組32只,正常組40只;根據(jù)局灶腦缺血時間分為正常假手術(shù)組,單純?nèi)毖? h,3 h,6 h,24 h,糖尿病局灶缺血1 h,3 h,6 h,24 h,每組8只;共 9 組 。

主要試劑、儀器:STZ(Sigma,美國),ASIC1a(一抗Santa,美國)血糖儀、血糖試紙(美國羅氏),水合氯醛(上海亞培生物有限公司,上海),重組人胰島素(美國禮來),TTC、檸檬酸緩沖液、DAB顯色試劑盒、羊抗兔 IgG(二抗)(博士德,武漢),照相顯微鏡(Olympus,日本),超速離心機(jī)(OptimaTM LE-80K,美國),凝膠分析系統(tǒng)(Biotech,美國)

1.2 模型建立

(1)糖尿病大鼠模型建立及評價

高脂飲食4周后,參考文獻(xiàn)[3]并按照試劑說明,制備pH=4.2的檸檬酸緩沖液。按30 mg/Kg稱取STZ,溶于檸檬酸緩沖液中,快速腹腔注射。7天后尾靜脈取血,測空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。血糖高于30 mmol/L剔除實驗,隨機(jī)補(bǔ)充。

(2)局灶腦缺血模型(MCAO)的建立及評價

MCAO模型以Longa[4]法為標(biāo)準(zhǔn)。待動物清醒后,觀察神經(jīng)系統(tǒng)癥狀以判斷手術(shù)是否成功。參考文獻(xiàn)[4]的5分制法進(jìn)行評分。0分:無神經(jīng)損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側(cè)前爪;2分:向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識喪失,5分:死亡。分值越高,說明動物癥狀越嚴(yán)重。造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn):以大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)右側(cè)肢體癱瘓,站立不穩(wěn),提尾時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。1-3分為納入標(biāo)準(zhǔn),0分、4分或死亡剔除,缺少的隨機(jī)補(bǔ)充。實驗中選取腦缺血24 h的大鼠進(jìn)行功能評分。

(3)TTC染色證實局灶腦梗死

造模后每組動物中取1只麻醉后,0.9%生理鹽水灌洗后,取腦,-20℃冰箱中速凍20 min,冠狀位每隔2 mm切片(5片)。切片置于2%TTC液中,避光放入37℃溫箱,每隔5-10 min翻動腦組織切片,使均勻接觸到染色液,30 min左右取出評價成功后,其余動物應(yīng)用上述方法取腦,留取左側(cè)大腦半球中間2/3皮層組織,-70℃冰柜保存。

1.3 蛋白免疫印記檢測

按操作說明進(jìn)行,Bandscan分析各條帶灰度,計算ASIC1a各條帶的強(qiáng)度與相對的β-actin條帶強(qiáng)度的比值,表示各組ASIC1a蛋白表達(dá)水平。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 應(yīng)用SSPS11.0軟件包,所得數(shù)據(jù)用±s表示,組間比較用 t檢驗,以 P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 血糖結(jié)果 所有糖尿病大鼠空腹血糖在19.7±2.38 mmol/L,符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 神經(jīng)功能評分

對糖尿病局灶腦缺血24 h及單純?nèi)毖?4 h大鼠進(jìn)行神經(jīng)評價,結(jié)果顯示糖尿病組大鼠術(shù)后清醒較晚,肢體偏癱程度重于單純?nèi)毖M,兩組相比差異顯著(P＜0.05)(見表1)。

表1 單純?nèi)毖c糖尿病局灶腦缺血24 h神經(jīng)功能評分(±s,n=5)

表1 單純?nèi)毖c糖尿病局灶腦缺血24 h神經(jīng)功能評分(±s,n=5)

兩者神經(jīng)功能評分相比,P＜0.05

n 神經(jīng)功能評分MCAO 24 h 8 1.80±0.837 DM+MCAO 24 h 8 2.60±0.591

2.3 TTC染色證實局灶腦梗死

正常腦組織為粉紅色,經(jīng)TTC染色后缺血的腦組織為蒼白色,在缺血1 h腦組織變化不明顯,缺血3 h可見左側(cè)半腦組織有小片狀蒼白區(qū),邊界不清;缺血6 h蒼白區(qū)明顯增大;缺血24 h可見腦組織缺血嚴(yán)重。在相同實驗條件下,結(jié)果顯示糖尿病大鼠腦缺血區(qū)面積明顯大于單純?nèi)毖M。

2.4 Western Blot法檢測單純?nèi)毖M及糖尿病缺血組不同缺血時間ASIC1a的表達(dá)變化

2.4.1 單純局灶腦缺血組不同缺血時間ASIC1a的表達(dá)變化

圖1為Western Blot法檢測單純局灶腦缺血組不同缺血時間ASIC1a蛋白表達(dá)變化。如圖1所示:上層目的條帶從左到右依次為假手術(shù)組、MCAO1 h、3 h、6 h 、24 h;下層為 β-actin。計算 ASIC1a/β-actin灰度比值為縱坐標(biāo),各缺血不同時間為分組變量橫坐標(biāo),直條圖變化如圖所示。結(jié)果顯示從MCAO1 h開始ASIC1a的表達(dá)增加,并與缺血時間呈依賴關(guān)系,24 h增加最明顯,組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。

2.4.2 糖尿病局灶腦缺血組不同缺血時間ASIC1a的表達(dá)變化

圖2為Western Blot法檢測糖尿病局灶腦缺血組不同缺血時間ASIC1a蛋白表達(dá)變化(上層目的條帶從左到右依次為 DM+MCAO1 h、3 h、6 h、24 h;下層為β-actin。計算ASIC1a/β-actin灰度比值為縱坐標(biāo),各缺血不同時間為分組變量橫坐標(biāo))。結(jié)果顯示從DM+MCAO1h開始ASIC1a的表達(dá)增加,并與缺血時間呈依賴關(guān)系,24 h增加最明顯。組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 單純?nèi)毖煌瑫r間ASIC1α表達(dá)變化

圖2 糖尿病局灶腦缺血組不同缺血時間ASIC1a表達(dá)變化

2.4.3 MCAO與DM+MCAO不同缺血時間各組ASIC1a的比較

通過上述結(jié)果,比較MCAO與DM+MCAO不同缺血時間ASIC1a的變化,結(jié)果顯示與MCAO對應(yīng)缺血時間相比DM+MCAO各組的ASIC1a明顯增高,尤以缺血24 h明顯。說明缺血時間越長,腦組織損傷越重;相同條件下糖尿病組損傷更重,組間比較P＜0.05。

3 討論

近年來有關(guān)ASIC1a與缺血性腦血管病的研究成為熱點[5]。研究表明在急性腦缺血時明顯激活了ASIC1a電流,加重腦損傷。Xiong等[6]發(fā)現(xiàn)一種從動物狼蛛體內(nèi)提取的毒素Psalmotoxinl(或PCTX1),它可以特異性阻斷ASIC1a電流,使腦短暫缺血病灶模型的梗死容積顯著減小。

ASIC1a電流增強(qiáng)加重腦損傷的原因在于它的開放可使Na+和Ca2+的通透性增加,引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,這是除谷氨酸的興奮毒性以外另一種引起鈣超載的原因[7]。Bayer K[8]的研究證實在腦缺血條件下,CaMKII依賴性磷酸化,激活A(yù)SIC1a通道上的Ser478和 Ser479位點,電流增強(qiáng)的同時加速Ca2+內(nèi)流。胞內(nèi)過量的Ca2+激活一連串的細(xì)胞毒性事件導(dǎo)致胞內(nèi)的酶激活,從而引發(fā)蛋白質(zhì)、脂類和核酸的降解,加重組織細(xì)胞損傷。在本研究中,我們檢測了局灶腦缺血不同時間缺血周圍皮層組織ASIC1a的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著缺血時間的延長,ASIC1a呈現(xiàn)逐漸增多趨勢,這一結(jié)果同文獻(xiàn)報道相一致,同樣也進(jìn)一步證實了隨著缺血時間的延長,腦組織損傷加重。

為了驗證在糖尿病基礎(chǔ)上的局灶腦缺血時是否存在ASIC1a表達(dá)的增加,我們應(yīng)用高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素STZ制備糖尿病大鼠模型,再用線栓法制備糖尿病大鼠局灶腦缺血模型,通過神經(jīng)功能評分及TTC染色,我們證實了糖尿病大鼠局灶腦缺血的缺血病灶及功能障礙明顯重于單純局灶腦缺血。免疫印記的結(jié)果顯示與單純局灶腦缺血各時間點相比,糖尿病組各個時間點ASIC1a的表達(dá)明顯增加。

綜上,我們得出結(jié)論糖尿病大鼠局灶腦缺血加重的原因是由于膜上ASIC1a電流增加,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增多,加重組織細(xì)胞損傷。因此封閉ASIC1a或者延遲ASIC1a的開放將是治療缺血性腦血管病的新靶點。

[1]Gründer S,Chen X.Structure,function,and pharmacology of acid-sensing ion channels(ASICs):focus on ASIC1a[J].Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol,2010,2(2):73.

[2]Xiang-Ping Chu,Natasha Close,Julie A.ASIC1a-Specific Modulation of Acid-Sensing Ion Channels in Mouse Cortical Neurons by Redox Reagents[J].The Journal of Neuroscience,2006,26(20):5329.

[3]Rees DA,Alcolado JC.Animal models of diabetes mellitus[J].Diabet Med,2005,22(4):359.

[4]Zea longa EL,Weisein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84.

[5]Pignataro G,Simon RP,Xiong ZG.Prolonged activation of ASIC1a and the time window for neuroprotection in cerebral ischaemia.Brain,2007,130(1):151.

[6]XiongZ G,Zhu XM,Chu XP,et al.Neuroprotection in ischemia:blocking calcium-permeable acid-sensing ion channels[J].Cell,2004,18(6):687.

[7]Mishra V,Verma R,Raghubir R.Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia:the possible role of ASIC1a[J].Neuropharmacology,2010,59(7-8):582.

[8]BayerKU,De Koninck P,Leonard AS,et al.Interaction with the NMDA receptor locks CaMKII in an active confor mation[J].Nature,2001,411(6839):801.