田艷霞,徐愛(ài)軍,劉 樺,盧鶴翔,李 冉,高俊玲

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北唐山063000)

載脂蛋白E(Apolipoprotein,apoE)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)不但在脂質(zhì)代謝中起到重要作用,而且,在抗炎、抗興奮毒性等方面也有作用[1-3],臨床資料顯示,蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)病人的腦積液中apoE水平降低表明apoE可能與SAH的發(fā)病及其愈后有關(guān)。apoE全蛋白分子量大,不能通過(guò)血腦屏障,影響了外源性的治療性應(yīng)用。近來(lái)研究合成了來(lái)自apoE受體結(jié)合區(qū)的擬apoE 12肽,分子量為1410D。擬apoE對(duì)實(shí)驗(yàn)性SAH有治療作用[4],但其作用機(jī)制尚有待探討。本試驗(yàn)選用外源性的擬apoE1410肽段作為SAH后的干預(yù)因素,觀察在SAH后apoE對(duì)額葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制,以期為臨床治療SAH提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性ICR小鼠210只,體重30-35 g,北京維通利華公司提供。小鼠隨機(jī)分成:①對(duì)照組;②SAH組;③apoE治療組。每組又分別劃分為傷后10 min、30min 、1h 、3h 、24h 、48h 、72h 7個(gè)時(shí)相組。

1.2 主要儀器和試劑 Cty-c兔抗鼠多克隆抗體(武漢博士德公司);Caspase-3兔抗鼠多克隆抗體(武漢博士德公司);山羊SABC法檢測(cè)試劑盒(武漢博士德公司);DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司);TUNEL試劑盒(Roche公司);擬apoE1410(美國(guó)北卡州立大學(xué))。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物給藥方法 apoE治療組以0.6 mg/kg,術(shù)前30分鐘開(kāi)始第一次,每12小時(shí)一次,共用三天,其它兩組只注射生理鹽水。

1.3.2 小鼠SAH模型的建立 按照Bederson[5]等方法加以修改,采用非開(kāi)顱血管內(nèi)穿刺法制備小鼠SAH模型,自右側(cè)頸外動(dòng)脈插入經(jīng)酒精處理的玻璃纖維至大腦中與大腦前交叉處的Villis環(huán)前部,刺破血管造成SAH。

1.3.3 免疫組織化學(xué) 按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,一抗(稀釋度為1∶100)4℃下孵育24 h,用相同稀釋比的PBS替代一抗作陰性對(duì)照,DAB溶液顯色。鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕黃色。陽(yáng)性細(xì)胞免疫反應(yīng)性強(qiáng)弱用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析其平均光密度值(OD)的大小來(lái)表示。

1.3.4 原位細(xì)胞DNA斷裂檢測(cè)(TUNEL法) 標(biāo)本制備步驟同免疫組化。TUNEL標(biāo)記反應(yīng)混合液(陰性對(duì)照只加等量核苷酸反應(yīng)液不含酶,其余均相同)37℃孵育1 h,POD-轉(zhuǎn)化液37℃孵育30 min,DAB顯色劑避光顯色。鏡下觀察,核呈藍(lán)色的為陽(yáng)性細(xì)胞。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)取其目鏡網(wǎng)格測(cè)微尺200倍光鏡視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)小鼠皮質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/高倍視野)作為分析對(duì)象進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 Ctyc及Caspase-3的蛋白表達(dá) Ctyc免疫陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色沉淀,定位于胞漿。對(duì)照組小鼠大腦額葉皮質(zhì)偶見(jiàn)Cytc免疫陽(yáng)性細(xì)胞。與對(duì)照組相比出血組Ctyc于SAH1小時(shí)略有表達(dá)、3小時(shí)明顯升高,24小時(shí)大量表達(dá),48 h后逐漸下降,與出血組比較apoE治療組免疫陽(yáng)性反應(yīng)在各時(shí)相點(diǎn)均降低,以24 h、48 h、72 h差異顯著(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞胞漿著棕黃色。對(duì)照組小鼠大腦額葉皮質(zhì)Caspase-3免疫反應(yīng)偶見(jiàn)表達(dá)。與對(duì)照組相比,SAH組3小時(shí)偶見(jiàn)Caspase-3免疫陽(yáng)性反應(yīng);24 h明顯升高,48 h大量表達(dá),72小時(shí)逐漸下降。與出血組比較,apoE治療組免疫陽(yáng)性反應(yīng)在各時(shí)相點(diǎn)均降低,以 24 h、48 h、72 h差異顯著(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組 Cytc免疫活性比較(±s,n=5)

表1 各組 Cytc免疫活性比較(±s,n=5)

注:與對(duì)照組相比 ▲P＜0.05,與出血組相比 *P＜0.05

時(shí)相 對(duì)照組 出血組 治療組10 min 2.37±0.35 2.52±0.53 2.34±0.42 30 min 2.46±0.86 2.91±1.35 2.75±1.32 1 h 3.95±1.76 4.56±1.11▲ 3.18±1.01▲3 h 3.98±2.32 6.57±2.35▲ 4.57±2.92▲*24 h 4.74±2.48 15.74±2.05▲ 12.32±2.09▲*48 h 3.42±1.32 11.83±1.76▲ 8.24±1.05▲*72 h 2.98±1.19 9.37±1.11▲ 5.83±1.15▲*

表2 各組 Caspase-3免疫活性比較(±s,n=5)

表2 各組 Caspase-3免疫活性比較(±s,n=5)

注:與對(duì)照組相比▲P＜0.05,與出血組相比 *P＜0.05

時(shí)相 對(duì)照組 出血組 治療組10 min 1.41±0.15 1.43±0.11 1.44±0.12 30 min 1.43±0.56 1.53±0.45 1.55±0.32 1 h 1.41±0.76 1.56±0.71 1.58±0.61 3 h 1.51±0.42 3.17±0.75▲ 3.09±0.12▲24 h 1.94±0.98 10.18±1.05▲ 8.32±0.09▲*48 h 2.30±0.32 14.83±1.76▲ 10.24±0.05▲*72 h 1.56±0.89 11.37±2.11▲ 7.43±0.15▲*

2.2 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組小鼠大腦額葉皮質(zhì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞偶見(jiàn)。SAH組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多,72 h達(dá)高峰。與對(duì)照組相比,SAH組的細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增多;apoE治療組在各時(shí)相點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)目不同程度減少,以 24 h、48 h、72 h差異顯著(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 皮質(zhì) TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比較(±s,n=5)

表3 皮質(zhì) TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比較(±s,n=5)

注:與對(duì)照組相比▲P＜0.05,與出血組相比 *P＜0.05

時(shí)相 對(duì)照組 出血組 治療組10 min 1.37±0.35 1.52±0.53 1.34±0.42 30 min 1.46±0.86 1.91±0.35 1.75±1.32 1 h 1.95±1.76 1.56±1.11 1.48±1.01 3 h 1.98±2.32 3.57±1.35▲ 3.57±0.92▲24 h 2.74±2.48 25.74±2.05▲ 17.32±2.09▲*48 h 3.42±1.32 31.83±1.76▲ 28.24±1.05▲*72 h 3.98±1.19 42.37±1.11▲ 35.83±1.15▲*

2.3 相關(guān)性分析 Cytc與TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈直線(xiàn)正相關(guān)(r=0.817,P＜0.01)、Caspase-3與 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈直線(xiàn)正相關(guān)(r=0.921,P＜0.01)、Cytc與 Caspase-3呈直線(xiàn)正相關(guān)(r=0.525,P＜0.01)。

3 討論

SAH是由于各種原因使血液進(jìn)入顱腔或椎管內(nèi)的蛛網(wǎng)膜下腔所引起的綜合征,分原發(fā)性和繼發(fā)性?xún)煞N。前者主要緣于血管壓力過(guò)高出血量大引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥,如腦血管痙攣、顱內(nèi)高壓、腦水腫等,后者的損傷機(jī)制比較復(fù)雜,涉及多種內(nèi)源性損傷因子(如谷氨酸)的釋放,最終引起神經(jīng)細(xì)胞死亡,導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙。最近研究發(fā)現(xiàn)[6],SAH后的神經(jīng)元缺損也可以由細(xì)胞凋亡引起,其凋亡現(xiàn)象已在人和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所證明[7、8]。本實(shí)驗(yàn)中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞于出血后24小時(shí)顯著表達(dá)、48小時(shí)明顯升高、72小時(shí)達(dá)高峰?？梢?jiàn),SAH時(shí)神經(jīng)細(xì)胞死亡可能通過(guò)神經(jīng)元凋亡途徑引起。

細(xì)胞色素C(Cytochrome,Cytc)是線(xiàn)粒體呼吸鏈必須的一類(lèi)色素蛋白,除參與細(xì)胞呼吸活動(dòng)外,在激活和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面具有重要意義。在神經(jīng)元凋亡過(guò)程中,Cytc通過(guò)線(xiàn)粒體外膜釋放,在ATP/dATP的參與下,在胞質(zhì)中與Apaf-1結(jié)合形成寡聚體,A-paf-1通過(guò)氨基酸與Caspase-9前體的功能前區(qū)相互作用凋亡信號(hào)刺激使其從線(xiàn)粒體釋放至細(xì)胞液,之后激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-3啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),凋亡的發(fā)生似乎是蛋白酶級(jí)聯(lián)切割過(guò)程,Caspase-3在這一過(guò)程中處于核心位置,被稱(chēng)為死亡蛋白酶,不同的蛋白酶切割Caspase-3促其激活,活化的Caspase-3又切割不同的底物,形成蛋白酶級(jí)聯(lián)切割放大機(jī)制,構(gòu)成凋亡的下游事件,最終導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生凋亡形態(tài)學(xué)和生化特征。研究發(fā)現(xiàn)將Cytc注入不同類(lèi)型的細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10],抑制Cytc的釋放能減輕腦損傷[11]。Clark等[12]在控制性皮質(zhì)沖擊傷模型中也證實(shí)了Caspase-3的活化參與了,急性腦損傷后腦組織的丟失,并觀察到Caspase-3在24小時(shí)達(dá)到高峰,應(yīng)用Caspase-3抑制劑后凋亡減輕。Kuawabara等[13]在椎動(dòng)脈穿刺模型中發(fā)現(xiàn),出血后早期(4小時(shí))即可檢測(cè)到Caspase-3,并且持續(xù)48小時(shí)。本實(shí)驗(yàn)中SAH3 h即可以檢測(cè)到Cytc的增加,24 h達(dá)高峰 ,48 h后下降,并且Cytc與TUNEL相關(guān)分析呈高度正相關(guān),證實(shí)在此模型中Cytc的產(chǎn)生可能參與SAH后皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中,出血后24小時(shí),皮質(zhì)神經(jīng)元中Caspase-3的表達(dá)呈逐漸增多趨勢(shì),于48小時(shí)達(dá)高峰,在頂葉及相鄰的額葉、枕葉、顳葉皮質(zhì)均可見(jiàn)Caspase-3大量表達(dá),與假手術(shù)組比較差異顯著(P＜0.01)。此外,Caspase-3蛋白的分布與表達(dá)其時(shí)相性及空間分布與其相鄰切片所標(biāo)記的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞分布大致符合。Cyt-c與Caspase-3呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明SAH后可能通過(guò)線(xiàn)粒體釋放Cytc激活Caspase-3途徑,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

apoE是正常人血漿脂蛋白中重要的載脂蛋白成分,主要功能為運(yùn)輸并介導(dǎo)某些脂蛋白與相應(yīng)的受體。近年來(lái)apoE在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用引起了廣泛關(guān)注。內(nèi)源性apoE或腦室內(nèi)apoE全蛋白通過(guò)下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激等作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14]。研究證實(shí)SAH后給予外源性apoE明顯改善了腦缺血和SAH的預(yù)后[15],但具體機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明apoE在明顯降低凋亡數(shù)量的同時(shí),對(duì)Cytc及Caspase-3其蛋白表達(dá)量也相應(yīng)減少,且TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與Cytc、Cytc與 Caspase-3、Caspase-3 與 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均呈正相關(guān),這也提示了apoE有明顯的腦保護(hù)作用,而且其機(jī)制可能是通過(guò)減低Cytc的釋放減少Caspase-3途徑的凋亡而發(fā)揮其腦保護(hù)作用。

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