張 丹,李希寧,孫 波

(1.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院心內(nèi)科,吉林 長(zhǎng)春130051;2.吉林大學(xué)藥學(xué)院)

尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ,UⅡ)是一種進(jìn)化上高度保守的生長(zhǎng)抑素樣環(huán)肽,最早從硬骨魚(yú)脊髓尾部下垂體中分離而來(lái),其分布具有種屬普遍性。Matsushita等[1]研究發(fā)現(xiàn)腎臟富含UⅡmRNA,現(xiàn)已證明,UⅡ?qū)δI臟來(lái)說(shuō)是一個(gè)自分泌或旁分泌的生長(zhǎng)因子[2],可能與人類(lèi)腎臟系統(tǒng)及其疾病的病理生理學(xué)有關(guān)。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠腎臟成纖維細(xì)胞株NRK-49F,觀察不同濃度UⅡ?qū)Υ笫竽I成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的影響,并且通過(guò)預(yù)先加入U(xiǎn)Ⅱ抗體、尼莫地平和EDTA,觀察其對(duì)UⅡ誘導(dǎo)NRK-49F細(xì)胞Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的影響,旨在探討UⅡ在腎間質(zhì)纖維化中可能發(fā)生的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源 大鼠腎臟成纖維細(xì)胞株NRK-49F細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心,以含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑 UⅡ(Sigma),逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptⅡ(Invitrogen),TaqDNA聚合酶(北京天根生物技術(shù)公司),山羊抗大鼠UⅡ多克隆抗體、兔抗大鼠Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ,colⅠ)、Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ,colⅢ)及纖連蛋白(fibronectin,FN)多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司),其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 MTT法檢測(cè)不同濃度UⅡ(1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7mol?L-1)對(duì)NRK-49F 細(xì)胞增殖的影響。

1.4 ELISA法檢測(cè)不同濃度UⅡ(1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7mol?L-1)對(duì)NRK-49F 各組培養(yǎng)上清colⅠ、colⅢ及FN含量的影響。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)各組培養(yǎng)細(xì)胞colⅠ、colⅢ及FN mRNA表達(dá) 根據(jù)加入條件培養(yǎng)基不同將細(xì)胞分為5組,對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、UⅡ組(用含10-8UⅡmol?L-1培養(yǎng)液培養(yǎng));U Ⅱ抗體組(用 10-5mol?L-1UⅡ抗體培養(yǎng)液預(yù)處理60 min后,換含UⅡ10-8mol?L-1培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng))、尼莫地平組(以10-5mol?L-1尼莫地平預(yù)處理5 min后,換含UⅡ10-8mol?L-1培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng));EDTA 組(用2×10-3mol?L-1EDTA預(yù)處理30 min后,換含UⅡ10-8mol?L-1培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng))。引 物序 列 如下:GAPDH上游 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng) 450 bp;ColⅠ :上游 5′-GCCACCTCAAGAGAAGTC-3′, 下 游 5′-ATAGCGACATCGGCAGGATC-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 441 bp;ColⅢ 上 游 5′-ATGGTGGCTTTCAGTTCAG-3′,下 游 5′-CAATGTCATAGGGTGCGATA-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng) 351 bp;FN 下游 5′-AAGGACCACAGGAGCAG T-3′,下 游 5′-CCTTTCTGAGCAGCAACC-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)411 bp。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析(one way ANOVA)進(jìn)行比較,組間兩兩比較采用最小顯著差(least significant difference,LSD)法。

2 結(jié)果

2.1 UⅡ?qū)RK-49F細(xì)胞增殖的影響 含不同濃度UⅡ(1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7mol?L-1)培養(yǎng)基作用NRK-49F 24 h后,MTT結(jié)果可見(jiàn),與對(duì)照組比較,不同濃度UⅡ刺激組A值均明顯增加,且當(dāng) UⅡ濃度為1×10-10、1×10-9和 1×10-8mol?L-1時(shí),A值隨著UⅡ濃度增加而增加,當(dāng)UⅡ濃度為1×10-8mol?L-1時(shí) ,A 值最大,見(jiàn)表1。

表1 不同濃度UⅡ?qū)RK-49F增殖能力的影響

2.2 UⅡ?qū)RK-49F分泌colⅠ 、colⅢ 及FN能力的影響 ELISA法檢測(cè)各組培養(yǎng)上清colⅠ、colⅢ及FN結(jié)果見(jiàn)表 2。10-9及 10-8mol?L-1UⅡ組 colⅠ、colⅢ 及FN含量均明顯增加,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05,**P＜0.01)。10-7mol?L-1UⅡ組上述三者含量與對(duì)照組比較,未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 UⅡ?qū)RK-49F分泌colⅠ、colⅢ 及FN能力的影響

2.3 UⅡ?qū)RK-49F colⅠ、colⅢ 及 FN mRNA表達(dá)影響 與正常對(duì)照組比較,10-8mol?L-1UⅡ組colⅠ、colⅢ 及FN mRNA表達(dá)量明增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與10-8mol?L-1UⅡ組比較,UⅡ抗體組上述三者mRNA表達(dá)量明均明顯降低(P＜0.01)。尼莫地平組和 EDTA組colⅠ、colⅢ mRNA表達(dá)量明顯低于10-8mol?L-1UⅡ組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),但FN mRNA表達(dá)量與10-8mol?L-1UⅡ組比較差異未見(jiàn)顯著性,見(jiàn)圖1。

3 討論

圖1 UⅡ?qū)RK-49F colⅠ 、colⅢ及FN mRNA表達(dá)影響

研究發(fā)現(xiàn),除血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)外,UⅡ還是體內(nèi)重要的促有絲分裂原,能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞及氣道平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞增殖[3]。新生大鼠離體心肌研究表明,UⅡ可呈劑量依賴(lài)性促進(jìn)心肌纖維化,推測(cè)其在心肌肥大及纖維化過(guò)程中起調(diào)控作用[4]。UⅡ在腎臟中的高表達(dá)提示其在腎臟具有特殊功能,可能與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究從其刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellar matrix,ECM)分泌的角度進(jìn)行探討,結(jié)果表明,一定濃度范圍內(nèi)(1×10-10,1×10-9,1×10-8mol?L-1),UⅡ可呈劑量依賴(lài)性刺激NRK-49F的增殖,并刺激其分泌colⅠ、colⅢ 及FN等ECM成分,本研究中,當(dāng)UⅡ濃度達(dá)到1×10-7mol?L-1時(shí),盡管其仍表現(xiàn)出明顯的刺激NRK-49F增殖能力,但培養(yǎng)細(xì)胞的ECM分泌能力未見(jiàn)明顯增加。

為探討UⅡ刺激腎臟成纖維細(xì)胞增殖及分泌ECM機(jī)制,本研究用＜去(NRK-49F)＞尼莫地平及EDTA對(duì) 1×10-8mol?L-1UⅡ刺激 NRK-49F合成ECM作用進(jìn)行干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼莫地平及EDTA均可明顯降低NRK-49F colⅠ、colⅢ 及FN mRNA的表達(dá)。尼莫地平屬雙氫吡啶類(lèi)鈣拮抗劑,可阻斷細(xì)胞膜上的鈣離子通道,從而抑制細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流,使細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平降低,EDTA是一種重要的Ca2+絡(luò)合劑,可使細(xì)胞外Ca2+濃度降低,二者均可使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流減少。有研究發(fā)現(xiàn),UⅡ可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞(NRK52E)的增殖,其機(jī)制與其刺激細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度升高密切相關(guān),尼莫地平及EDTA可顯著抑制此效應(yīng)[5]。Iglewski等發(fā)現(xiàn),UⅡ與其受體結(jié)合,可激活第二信使三磷酸肌醇(inositol triphosphate,I P3)及二酯酰甘油(diacylglycerol,DG),并導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加,Ca2+內(nèi)流增加導(dǎo)致Ca2+依賴(lài)的激酶(Ca2+-dependent kinases,CaMK)活性增加,從而引起細(xì)胞增殖[6]。這些研究結(jié)果提示UⅡ的促絲裂原效應(yīng)通過(guò)Ca2+來(lái)介導(dǎo)。但有關(guān)UⅡ刺激細(xì)胞合成和分泌ECM的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中,尼莫地平和EDTA均可明顯抑制UⅡ介導(dǎo)的NRK-49F colⅠ、colⅢ mRNA高表達(dá),即抑制腎臟成纖維細(xì)細(xì)胞的ECM合成能力,表明UⅡ的促腎間質(zhì)纖維化的作用也可能與Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述,可以推測(cè)UⅡ通過(guò)與G蛋白耦聯(lián)受體相結(jié)合,促進(jìn)細(xì)胞外鈣內(nèi)流及細(xì)胞內(nèi)鈣貯釋放,使細(xì)胞質(zhì)Ca2+增加,并激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激活初始應(yīng)答基因,表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子,從而引起細(xì)胞增殖及ECM的過(guò)度表達(dá),因此,UⅡ可能成為抑制腎間質(zhì)纖維化治療的一個(gè)新靶標(biāo),當(dāng)然其具體機(jī)制尚需進(jìn)行更深入探討。

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