薛園園,郭興鳳,程超男,吳欣欣

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450052)

風(fēng)味蛋白酶水解豌豆蛋白的條件優(yōu)化

薛園園,郭興鳳＊,程超男,吳欣欣

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450052)

對風(fēng)味蛋白酶水解豌豆蛋白的條件進(jìn)行了研究,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法,優(yōu)化蛋白酶水解豌豆蛋白的最佳條件為溫度 48.8℃、pH6.2、酶與底物濃度比 (E/S)4%、底物濃度 6.34%、水解時(shí)間 3.9 h,最佳水解條件下的水解度為 14.55%.

風(fēng)味蛋白酶;豌豆蛋白質(zhì);水解;響應(yīng)面方法

0 前言

豌豆屬豆科植物,在我國已有兩千多年的栽培歷史,現(xiàn)在各地均有栽培,主要產(chǎn)區(qū)有四川、河南、湖北、江蘇、青海等十多個(gè)省區(qū).為了生產(chǎn)高蛋白食品,豆類種籽蛋白的開發(fā)利用已引起世界各國的關(guān)注[1-2],豌豆也日益受到重視.豌豆的成熟種籽中含有 20%～30%的蛋白質(zhì),豌豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),氨基酸的比例較平衡,人體所需的8種必需氨基酸除蛋氨酸的含量較低外,其余均達(dá)到 FAO/WHO的推薦模式值[3-4].豌豆蛋白具有許多優(yōu)良功能特性,如溶解性、凝膠形成性、乳化性、耐熱耐鹽性等[5].據(jù)報(bào)道,從豌豆中提純的蛋白質(zhì)水解物可以防治腎病和高血壓,因此水解豌豆蛋白具有重要的研究價(jià)值.

植物蛋白水解物 (HVP)是一種營養(yǎng)型的食品添加劑,廣泛應(yīng)用于肉制品、方便面、膨化食品以及調(diào)味品中[6].水解植物蛋白的主要方法有酸水解、堿水解和酶水解.與酸、堿水解法相比較,酶法水解植物蛋白具有許多優(yōu)點(diǎn)[7-8],因此,目前普遍采用的是酶水解方法.經(jīng)過水解分離精制得到的多肽,具有高溶解性、高穩(wěn)定性、高吸濕保濕性、抗凝膠性等特點(diǎn)[9-10],尤其是小分子肽,人體吸收速度快,利用率高,同時(shí)具有多種生物活性[11].目前,活性肽和蛋白水解的研究主要集中在大豆蛋白、乳蛋白、魚蛋白方面,對豌豆蛋白的研究很少.作者研究了風(fēng)味蛋白酶酶解豌豆蛋白的工藝參數(shù),為進(jìn)一步利用豌豆蛋白提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料和方法

1.1 主要原料和試劑

豌豆蛋白粉:蛋白質(zhì)含量 67.38%,生產(chǎn)豌豆淀粉的副產(chǎn)物,山東健源食品有限公司;風(fēng)味蛋白酶:活力 500 LAPU/g,Novo Nordisk;其他試劑均為分析純.

1.2 主要設(shè)備

722S可見光分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;101型電熱鼓風(fēng)干燥箱:北京市永光明醫(yī)療儀器廠;CHA—S氣浴恒溫振蕩器:金壇市華鋒儀器有限公司;SHZ—88水浴恒溫振蕩器:江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;數(shù)顯恒溫水浴鍋:北京中興偉業(yè)儀器有限公司.

1.3 分析方法

1.3.1 豌豆蛋白粉中各組分的測定

粗蛋白含量的測定:GB/T5009.5-2003;水分的測定:GB/T5009.3-2003;灰分的測定:GB/T5009.4-2003;粗脂肪的測定:GB/T5009.6-2003;NSI值的測定:GB5511-85.

1.3.2 蛋白質(zhì)水解度 (DH)的測定

茚三酮比色法[12].

1.3.3 酶水解豌豆蛋白的方法

稱取一定量的豌豆蛋白粉,用磷酸氫二鈉 -檸檬酸緩沖液配成一定濃度的懸浮液,加入一定量的酶,將所得懸浮液放入設(shè)置不同溫度的氣浴恒溫振蕩器中振蕩酶解,到所需反應(yīng)時(shí)間后取出酶解液放在 90℃水浴中加熱 10 min,滅活酶以終止反應(yīng),之后立即冷卻至室溫,將酶解液定容至100 mL,濾紙過濾,取上清液測定水解度,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù) 2次,試驗(yàn)結(jié)果用平均值 ±偏差表示.

水解度的計(jì)算公式:

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以溫度、pH值、底物濃度、加酶量 4個(gè)因素為自變量 (分別以 A、B、C、D表示),以水解度為響應(yīng)值設(shè)計(jì)了 4因素 3水平共 21個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn),因素水平的選取根據(jù)單因素試驗(yàn)確定.

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆蛋白粉的組成

豌豆蛋白粉的主要成分見表1.

表1 _豌豆蛋白粉的主要成分%

2.2 各因素對風(fēng)味蛋白酶水解豌豆蛋白質(zhì)水解度的影響

2.2.1 加酶量 (E/S)對水解度的影響

底物濃度為 5.0%,pH7.0,溫度50.0℃,酶解時(shí)間 3.0 h,加酶量分別為 1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%.加酶量對水解度的影響如圖 1所示.

圖1 加酶量 (E/S)對水解度的影響

由圖 1可以看出,隨著加酶量的增加,水解度逐漸增加,最后趨于平緩,當(dāng)加酶量為 4.0%時(shí),水解度為 15.24%,當(dāng)加酶量為 5.0%,水解度為16.56%,增加的幅度很小,這是因?yàn)榧用噶吭谝欢ǚ秶鷥?nèi),隨著加酶量的提高,反應(yīng)體系水解度逐漸上升,當(dāng)加酶量超出一定范圍后,由于酶濃度逐漸飽和,使酶解速度的增加趨于飽和[13],此時(shí)繼續(xù)增大加酶量對反應(yīng)速率無大的影響,因此選擇加酶量 (E/S)在 4.0%左右對水解度進(jìn)行考察.

2.2.2 酶解時(shí)間對水解度的影響

底物濃度為 5.0%,pH7.0,溫度50.0℃,加酶量為 4.0%,酶解時(shí)間分別為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h.酶解時(shí)間對水解度的影響如圖 2所示.

圖2 水解時(shí)間對水解度的影響

由圖 2可以看出,隨著水解時(shí)間的延長,酶與底物作用充分,水解度逐漸增加,當(dāng)達(dá)到 4 h后水解度變化趨于平緩.這是因?yàn)殡S著時(shí)間的繼續(xù)增加,底物濃度減少,產(chǎn)物濃度增加,由于產(chǎn)物對酶的抑制作用,使得酶活力下降,從而導(dǎo)致水解度降低[14].綜合考慮,水解時(shí)間選擇 4.0 h.

2.2.3 底物濃度對水解度的影響

酶解時(shí)間為 4.0 h,pH7.0,溫度 50.0℃,加酶量為 4.0%,底物濃度分別為4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%、9.0%、10.0%.底物濃度對水解度的影響如圖 3所示.

圖3 底物濃度對水解度的影響

由圖 3可以看出,當(dāng)?shù)孜餄舛仍?3.0%～6.0%之間時(shí),水解度呈上升趨勢,在 6.0%處最大,繼續(xù)增大底物濃度,水解度呈下降趨勢.因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí),酶分子與底物碰撞機(jī)會(huì)很大,反應(yīng)較劇烈,隨著底物濃度提高,體系底物濃度過大,溶液流動(dòng)性下降,因此就降低了底物和蛋白酶的擴(kuò)散和運(yùn)動(dòng),使水解反應(yīng)受到抑制[15],水解度逐漸下降,為了提高生產(chǎn)效率可適當(dāng)增加底物濃度,底物濃度選擇為 6.0%左右.

2.2.4 溫度對水解度的影響

酶解時(shí)間為 4.0 h,pH7.0,底物濃度為6.0%,加酶量為 4.0%,溫度分別為 40.0、45.0、50.0、55.0、60.0℃.水解溫度對水解度的影響如圖 4所示.

圖4 水解溫度對水解度的影響

溫度對酶催化反應(yīng)的影響有兩個(gè)方面,一是溫度升高會(huì)使反應(yīng)速度加快,二是隨著溫度的升高,酶失活速度也加快,即通過減少有活性的酶降低酶的反應(yīng)速度[16].在水解的最初階段,第一個(gè)方面的影響占主導(dǎo)地位,水解度隨著溫度的升高而增加,但當(dāng)溫度高過最適溫度的時(shí)候,第二個(gè)方面的影響占主導(dǎo)地位,水解度隨著溫度的升高而降低.在最適溫度時(shí),酶的活力最大[17],因此,最適的水解溫度為 50.0℃.

2.2.5 pH對水解度的影響

酶解時(shí)間為 4.0 h,底物濃度為 6.0%,溫度50.0℃,加酶量為 4.0%,pH分別為 5.0、5.6、6.2、6.8、7.4.pH對水解度的影響如圖 5所示.

圖5 pH對水解度的影響

由圖 5可以看出,蛋白質(zhì)的水解度隨著 pH的升高先增大后減小,不同的酶最適 pH不同,在其最適 pH附近,酶的活力最大,與底物的作用最充分,水解度最大,在偏酸或者偏堿的環(huán)境中,由于酶部分變性而失活[18],因?yàn)?pH使得酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞,引起酶變性,從而導(dǎo)致酶構(gòu)象的改變,酶活性隨之喪失.因此,通過試驗(yàn)得出水解液較佳的 pH值為 6.8.

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

響應(yīng)面分析法 (response surface methodology,簡稱 RS M)是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過試驗(yàn)得到一定的數(shù)據(jù),采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)的工藝參數(shù).

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,固定加酶量4.0%,選取溫度 (A)、pH(B)、底物濃度 (C)、時(shí)間 (D)為變量進(jìn)行二次回歸設(shè)計(jì)試驗(yàn)和分析.以豌豆蛋白質(zhì)的水解度 (Y)為響應(yīng)值設(shè)計(jì)了 4因素3水平共 21個(gè)試驗(yàn)點(diǎn) (5個(gè)中心點(diǎn)).21個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可以分為兩類:一為析因點(diǎn),自變量取值在 4個(gè)因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn),共有 16個(gè);二為中心點(diǎn),中心點(diǎn)重復(fù) 5次,用以估計(jì)誤差.試驗(yàn)方案及結(jié)果列于表2、表3中.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以水解度為響應(yīng)值,經(jīng)回歸擬合后,各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響可用二次方程表示:

運(yùn)用 Design-Expert 6.0軟件對 21個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析,風(fēng)味蛋白酶水解豌豆蛋白質(zhì)的水解度回歸方程的方差分析如表4所示,響應(yīng)面分析圖如圖 6所示.

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)的 RS M方差分析

圖6 各因素對水解度影響的響應(yīng)面圖

由表4可以看出,所建立的模型是顯著的.在所選的試驗(yàn)條件下,因素對溫度 (A)、pH(B)、時(shí)間 (D)、溫度的二次項(xiàng) (A2)、pH的二次項(xiàng) (B2)影響更顯著,底物濃度的二次項(xiàng) (C2)影響顯著,交互作用中 pH和酶解溫度的交互作用 (AB)、底物濃度和 pH的交互作用 (BC)、底物濃度和時(shí)間交互作用(CD)影響顯著.在因素水平的范圍內(nèi),水解度隨著溫度、pH、底物濃度的升高先升高后降低,隨著時(shí)間的增加水解度逐漸增加,最后趨于平緩.對回歸方程進(jìn)行偏微分,在試驗(yàn)范圍內(nèi),進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,得出最佳的工藝條件為 pH 6.2,底物濃度 6.34%,加酶量 4.0%,溫度 48.8℃,時(shí)間 3.9 h,水解度的預(yù)測值為 14.42%,而在此工藝條件下,做驗(yàn)證試驗(yàn)得到的豌豆蛋白的水解度為14.55% ±0.18%,響應(yīng)值的試驗(yàn)值與回歸方程的預(yù)測值吻合良好.

3 結(jié)論

以風(fēng)味蛋白酶水解豌豆蛋白粉,響應(yīng)面方法優(yōu)化得到最佳的水解工藝為 pH 6.2、底物濃度6.34%、加酶量 4.0%、水解溫度 48.8℃、水解時(shí)間 3.9 h,在此條件下豌豆蛋白的水解度預(yù)測值為14.55%.在最佳條件下進(jìn)行水解,豌豆蛋白水解度得到了較大提高.

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OPTIM IZATION OF ENZY MATIC HYDROLYSIS COND ITI ONS OF PEA PROTEIN BY FLAVOURZY ME

XUE Yuan-yuan,GUO Xing-feng,CHENG Chao-nan,WU Xin-xin
(School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou450052,China)

The paper studied the enzymatic hydrolysis conditionsof pea protein by flavourzyme.On the basisof the single factor experi ments,we carried out the response surface method to opti mize the enzymatic hydrolysis conditions.The results showed that the opti mal enzymatic hydrolysis conditionswere as follows:reaction temperature 48.8℃,pH 6.2,the concentration ratio of enzyme to substrate 4%,substrate concentration 6.34%,and reaction time 3.9 hours;under optimal conditions,the degree of hydrolysis of pea protein was 14.55%.

flavourzyme;pea protein;hydrolysis;response surface method

TS201.2

B

1673-2383(2011)01-0005-05

2010-10-11

薛園園 (1985-),女,河南開封人,碩士研究生,主要從事植物蛋白的研究.

＊通信作者