張 穎，Gary Guishan Xiao，榮培晶，劉梅潔，汪文萊，王少君，于智敏，劉 紅，潘靜華，于 崢，趙宏艷，鞠大宏△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;2.Osteoporosis Research Center，Creighton University，USA;3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京 100700)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)是一種與衰老有關(guān)的常見病，主要發(fā)生在絕經(jīng)后婦女。由于雌激素缺乏導(dǎo)致骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)變化，伴有骨脆性增加及易導(dǎo)致骨折的一種慢性疾病，屬中醫(yī)“痹證”、“骨痿”等范疇。中藥杜仲、千年健均有補(bǔ)腎健骨的作用。如《神農(nóng)本草經(jīng)》記載杜仲藥效為“補(bǔ)中，益精氣，堅(jiān)筋骨……久服輕身耐老”?！讹嬈聟ⅰ酚涊d千年健的功效為“強(qiáng)筋骨，治肢節(jié)酸疼”?；谝陨险J(rèn)識(shí)，本實(shí)驗(yàn)以去卵巢大鼠為模型，以探討杜仲和千年健對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用和機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用雌性 Wistar大鼠72只，清潔級(jí)，體重230g～270g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK-(軍)2002-001)。動(dòng)物于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室許可證號(hào)SYXK(京)-2005-0024)。

1.1.2 藥物 杜仲購(gòu)自四川省宜賓市中宏藥業(yè)有限公司，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所生藥室鑒定，為杜仲科(Eucomiaceae)杜仲屬杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮。千年健購(gòu)自廣西平安堂藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所生藥室鑒定，為天南星科(Araceae)千年健屬千年健 Homalomena occulta(Lour.)Schott的干燥根莖。以上各藥加水煎煮，藥液濃縮至1g生藥/ml的濃度。

1.1.3 主要試劑 大鼠護(hù)骨素 (Osteoprotegerin，OPG)、細(xì)胞核因子-κB 受體活化因子配基(Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)免疫組化試劑盒:美國(guó) Santa cruze;大鼠 OPG、RANKL原位雜交試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供;鹽酸四環(huán)素由欣惠澤奧科技有限公司公司提供。

1.1.4 主要儀器 OM2563冰凍切片機(jī):美國(guó)TBS公司;Reicheit-Jung2040切片機(jī):德國(guó);Qwin圖像分析儀系統(tǒng):德國(guó)Leica公司;Wellwash 4 Mk2洗板機(jī):美國(guó) Thermo公司;Multiskan Mk3酶標(biāo)儀:美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 選將72只大鼠隨機(jī)分為3組，其中空白對(duì)照組12只，假手術(shù)組12只和造模組48只。造模組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后摘除雙側(cè)卵巢［1］，假手術(shù)組只摘取少量脂肪組織。術(shù)后1個(gè)月再將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、杜仲組、千年健組4組，每組12只。然后開始灌胃給藥，杜仲組、千年健組為1g生藥/mL的水煎劑，給藥體積為5.6mL/kg體重，即給藥劑量均為5.6g生藥/kg體重;陽(yáng)性對(duì)照組給予0.008mg/mL己烯雌酚，給藥體積為 5.6mL/kg體重，即給藥劑量為0.0448mg/kg體重?？瞻讓?duì)照組、假手術(shù)組、模型組則灌服等體積的蒸餾水。以上灌胃給藥3個(gè)月，1d 1次，連續(xù)6d，休息1d。大鼠處死前15d和前3d腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體重，對(duì)骨進(jìn)行熒光標(biāo)記。給藥結(jié)束后，各組大鼠以45mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，股動(dòng)脈取血。大鼠處死后取右側(cè)脛骨制作不脫鈣骨切片，取左側(cè)脛骨制作脫鈣的冰凍切片。

1.2.2 指標(biāo)的檢測(cè)方法 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的測(cè)定:取右側(cè)脛骨近端1/3，除凈周圍附著的軟組織，采用塑料包埋方法制作不脫鈣骨切片:一張切片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，另一張切片直接用于熒光觀察。采用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)，按章明放等人的方法對(duì)不脫鈣骨切片進(jìn)行形態(tài)計(jì)量［2］。

成骨細(xì)胞(OB)和骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSC)OPG、RANKL蛋白及其mRNA表達(dá)的檢測(cè):取左側(cè)脛骨近端1/3，按照文獻(xiàn)［3］中所述方法進(jìn)行標(biāo)本處理，采用免疫組化方法檢測(cè)OB和MSC OPG、RANKL蛋白的表達(dá)，采用原位雜交法檢測(cè)其mRNA表達(dá)。并用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)對(duì)OPG、RANKL蛋白及其mRNA表達(dá)陽(yáng)性密度進(jìn)行計(jì)量。

2 結(jié)果

2.1 杜仲、千年健對(duì)卵巢切除大鼠脛骨骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響

2.1.1 杜仲、千年健對(duì)卵巢切除大鼠脛骨骨小梁體積百分比(TBV%)的影響 表1顯示，模型組大鼠脛骨TBV%較假手術(shù)組明顯降低。杜仲組、千年健組TBV%顯著高于模型組，明顯低于假手術(shù)組。陽(yáng)性對(duì)照組TBV%顯著高于模型組，與假手術(shù)組相比無(wú)顯著性差異。

表1 各組大鼠脛骨TBV%的變化

2.1.2 杜仲、千年健對(duì)卵巢切除大鼠脛骨骨小梁吸收表面百分比(TRS%)的影響 表2顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脛骨 TRS%顯著升高。杜仲組、千年健組TRS%明顯低于模型組，明顯高于假手術(shù)組。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組TRS%顯著降低，與假手術(shù)組相比無(wú)顯著性差異。

2.1.3 杜仲、千年健對(duì)卵巢切除大鼠脛骨骨小梁形成表面百分比(TFS%)、骨小梁礦化率(MAR)的影響

表2 各組大鼠脛骨TRS%的變化

表3顯示，模型組大鼠脛骨 TFS%、MAR較假手術(shù)組顯著增高，千年健組TFS%、MAR明顯低于模型組，而杜仲組無(wú)顯著性變化。與假手術(shù)組相比，杜仲組、千年健組 TFS%、MAR明顯增高。陽(yáng)性對(duì)照組TFS%、MAR與模型組相比明顯降低，與假手術(shù)組相比無(wú)顯著性差異。

2.1.4 杜仲、千年健對(duì)卵巢切除大鼠脛骨骨皮質(zhì)礦化率(mAR)和骨皮質(zhì)類骨質(zhì)平均寬度(OSW)的影響 表4顯示，模型組大鼠脛骨mAR和OSW皆高于假手術(shù)組。與模型組相比，千年健組和OSW明顯降低，mAR無(wú)顯著性差異，杜仲組mAR和OSW均無(wú)顯著性改變;與假手術(shù)組相比，杜仲組和千年健組mAR明顯升高，OSW均無(wú)顯著性差異。陽(yáng)性對(duì)照組的mAR和OSW與模型組比較，顯著降低，與假手術(shù)組相比無(wú)顯著性差異。

表3 各組大鼠脛骨TFS%和MAR的變化

表4 各組大鼠脛骨mAR和OSW的變化

2.2 杜仲、千年健對(duì)卵巢切除大鼠脛骨 OB、MSC OPG和RANKL蛋白表達(dá)的影響

2.2.1 杜仲、千年健對(duì)卵巢切除大鼠脛骨 OB和MSC OPG蛋白表達(dá)的影響 表5顯示，模型組大鼠脛骨OB和MSC OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均明顯低于假手術(shù)組。與模型組相比，千年健組 OB和MSC OPG蛋白表達(dá)均明顯升高，杜仲組無(wú)顯著性差異;與假手術(shù)組相比，杜仲組、千年健組OB和 MSC OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均明顯降低。陽(yáng)性對(duì)照組OB和MSC OPG蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均明顯高于模型組，與假手術(shù)組相比無(wú)顯著性差異。

表5 各組大鼠脛骨OB和MSC OPG蛋白表達(dá)的變化

2.2.2 杜仲、千年健對(duì)卵巢切除大鼠脛骨 OB和MSC RANKL蛋白表達(dá)的影響 表6顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脛骨OB和MSC RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度均明顯升高。與模型組相比，杜仲組、千年健組 OB和 MSC RANKL蛋白表達(dá)明顯降低。與假手術(shù)相比，杜仲組MSC RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度升高，OB RANKL蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異;千年健組OB和MSC RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度較假手術(shù)組均明顯升高。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組OB和MSC RANKL蛋白表達(dá)陽(yáng)性密度明顯降低，與假手術(shù)組相比無(wú)顯著性差異。

表6 各組大鼠脛骨OB和MSC RANKL蛋白表達(dá)的變化

2.3 杜仲、千年健對(duì)卵巢切除大鼠脛骨 OB和MSC OPG和RANKL mRNA表達(dá)的影響

2.3.1杜仲、千年健對(duì)卵巢切除大鼠脛骨OB和MSC OPG mRNA表達(dá)的影響 表7顯示，模型組大鼠脛骨OB和MSC OPG mRNA表達(dá)陽(yáng)性密度較假手術(shù)組顯著降低。千年健組OB和MSC OPG mRNA的陽(yáng)性密度明顯高于模型組，而杜仲組則無(wú)顯著性變化。與假手術(shù)組相比，杜仲組、千年健組 OB和MSC OPG mRNA表達(dá)均明顯降低。陽(yáng)性對(duì)照組OB和MSC OPG mRNA表達(dá)較模型組明顯升高，與假手術(shù)組相比無(wú)顯著性差異。

表7 各組大鼠脛骨OB和MSC OPG mRNA表達(dá)的變化

2.3.2 杜仲、千年健對(duì)卵巢切除大鼠脛骨 OB和MSC RANKL mRNA表達(dá)的影響 表8顯示，模型組大鼠脛骨OB和MSC RANKL mRNA表達(dá)陽(yáng)性密度均明顯高于假手術(shù)組。與模型組相比，杜仲組、千年健組OB和MSC RANKL mRNA表達(dá)均明顯降低;與假手術(shù)組相比，千年健組 MSC RANKL mRNA表達(dá)陽(yáng)性密度明顯升高，杜仲組OB和MSC RANKL mRNA表達(dá)以及千年健組OB RANKL mRNA表達(dá)均無(wú)顯著性差異。陽(yáng)性對(duì)照組OB和MSC RANKL mRNA表達(dá)陽(yáng)性密度均明顯低于模型組，與假手術(shù)組相比無(wú)顯著性差異。

表8 各組大鼠脛骨OB和MSC RANKL mRNA表達(dá)的變化

與空白對(duì)照組比較，假手術(shù)組的上述指標(biāo)均無(wú)顯著性差異，從而排除了手術(shù)本身對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是由于絕經(jīng)后雌激素迅速減少致使骨量丟失加快［4］。本研究以卵巢切除大鼠為模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢切除后大鼠脛骨TBV%顯著降低，代表骨吸收參數(shù)的TRS%和代表骨形成參數(shù)的TFS%、MAR、mAR和 OSW 均顯著增高，因此本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理相似，為骨吸收大于骨形成的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥模型。給藥3個(gè)月后，杜仲組的TBV%和TRS%均有明顯逆轉(zhuǎn);千年健組除mAR以外，其他指標(biāo)均明顯逆轉(zhuǎn)。由此可見，杜仲主要以降低骨吸收來(lái)達(dá)到對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療，而千年健既能抑制骨吸收，同時(shí)又能抑制骨形成，使骨形成大于骨吸收而達(dá)到對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療作用。

模型組大鼠脛骨OB和MSC OPG蛋白及其mRNA的表達(dá)均明顯低于假手術(shù)組，OB和 MSC RANKL蛋白及其mRNA的表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組，提示當(dāng)雌激素缺乏時(shí)則抑制OB和MSC OPG蛋白表達(dá)減少，但促進(jìn) RANKL蛋白的表達(dá)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，OPG、RANKL是非常重要的破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)信號(hào)因子。OPG對(duì)破骨細(xì)胞的作用是多方面的，它可以抑制破骨細(xì)胞的分化、融合、激活，并促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡。RANKL是直接刺激破骨細(xì)胞發(fā)育和使之激活的細(xì)胞因子，它與破骨細(xì)胞表面受體RANK結(jié)合，強(qiáng)有力地促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成、分化、成熟，并抑制破骨細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)其存活［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，杜仲組、千年健組 OB和MSC RANKL蛋白及其mRNA的表達(dá)較模型組均明顯降低，提示杜仲和千年健對(duì)大鼠脛骨OB和MSC RANKL蛋白及其mRNA的表達(dá)有明顯的抑制作用;同時(shí)，千年健組OB和MSC OPG蛋白及其mRNA表達(dá)較模型組均明顯提高，表明千年健對(duì)OB和MSC OPG蛋白及其mRNA表達(dá)有一定的促進(jìn)作用。

綜上所述，杜仲、千年健對(duì)卵巢切除所致的大鼠骨質(zhì)疏松癥均具有一定的治療作用。從治療作用環(huán)節(jié)來(lái)看兩者各有特點(diǎn):千年健不僅可以增加OB和MSC OPG蛋白及其 mRNA表達(dá)，還能抑制RANKL蛋白及其 mRNA的表達(dá);杜仲是通過(guò)抑制 OB和MSC RANKL蛋白及其mRNA表達(dá)，從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的。

［1］鞠大宏，張春英，王安民，等.溫補(bǔ)腎陽(yáng)方對(duì)去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥大鼠IL-1和IL-6活性的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6(4):29-32.

［2］章明放，張乃鑫，譚郁彬.運(yùn)動(dòng)對(duì)雌性大鼠去勢(shì)后骨質(zhì)疏松癥的作用［J］.中華骨科雜志，1994，14(6):365-369.

［3］鞠大宏，于福祿，張麗坤，等.滋陰補(bǔ)腎法對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞COX-2蛋白和 mRNA表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006，12(12):918-920.

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［5］劉梅潔，鞠大宏，趙宏艷.“腎主骨”的機(jī)理研究—左歸丸含藥血清對(duì)破骨細(xì)胞分化調(diào)控因子OPG、RANKL蛋白表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15(3):184-187.