李志勇,譚 鵬,趙 暉,李 飛,孫建寧△

(1.中央民族大學中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學研究院,北京100081;2.北京中醫(yī)藥大學中藥學院,北京100012;3.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院,北京100069)

含有烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿(hypaconitine,HA)等生物堿的天然藥物主要包括附子、川烏、草烏、雪上一枝蒿等藥材,因含有上述毒性成分在臨床應用中極易發(fā)生中毒,損傷機體神經(jīng)系統(tǒng)與心血管系統(tǒng),最突出的體征為心律失常[1-4]。有研究顯示,HA在附子炮制品及中成藥中都有存在[5-8],且附子的毒-效表達與烏頭堿、中烏頭堿、HA在炮制過程中的差異配比存在相關性[9],HA在正常大鼠及離體心臟、原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞上都能引發(fā)嚴重心律失常[10-11]。現(xiàn)將HA對心肌細胞L-鈣通道α1C亞基、細胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白(CaM)及肌質(zhì)網(wǎng)上雷諾定受體(Ry R2)mRNA表達的影響報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與藥品 3 d乳大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)雌雄不拘,動物許可證號:SCXK(京)2002-0003。HA;(中國食品藥品檢定研究院),批號:200404,純度大于或等于98%,用二甲基亞砜(DMSO)溶解,制成貯備液。

1.2 試劑與儀器 達氏修正依氏培養(yǎng)基/F12(DMEM/F12)購自美國sigma公司,批號 086K 83521;胰蛋白酶、膠原酶Ⅱ型(CoⅡ)、四噻唑蘭(MTT)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA Na2)購自美國Amresco公司;5-溴-2-脫氧尿核苷購自Brd U,Roche公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司,批號071031;First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司,批號 00020634;SYBR Green PCR Master Mix購自 Applied Biosystems公司,批號43049155。CJT型超凈工作臺購自北京昌平長城空氣凈化設備公司;RCO-3000T-5V型CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國G.S.公司;DMILHC倒置相差顯微鏡購自德國Leica公司;YXOGO2型電熱式蒸汽消毒器購自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;400R低溫離心機購自德國Heraeus公司;GeneAmp 5700 TaqMAN PCR儀購自美國AppliedBiosystems公司;凝膠圖像分析儀、ImageMaster VDS購自美國pharmacia Biotech公司;OYY-Ⅲ-5型電泳儀購自北京六一儀器廠;YLD-2000電熱恒溫鼓風干燥箱購自黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;HZQ-C空氣浴振蕩器購自哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠。

表1 引物序列

1.3 方法

1.3.1 心肌細胞制備與培養(yǎng) 超凈工作臺內(nèi)無菌條件下取出乳鼠心臟,在預冷D-Hank′s液中清洗3～4次。將心肌組織剪為1 mm3大小,加入3倍體積量的消化酶(終濃度0.04%的胰酶和終濃度0.04%的CoⅡ混合液,用前混勻),放于 37℃,每分鐘30～40轉空氣浴振蕩10～20 min,反復至消化完全,除第1次外,收集各次消化后的上清液,加入等體積含10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化,于4℃,1 000 r/min離心10 min,收集所有細胞,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,吹打成單細胞懸液,經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾去除未消化的組織塊。接種于25 cm2的卡式培養(yǎng)瓶中,置于 37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中,用差速貼壁法分離非心肌細胞,每次90 min,共2次。所得未貼壁細胞(心肌細胞)計數(shù),按 8×105cell/m L接種于6孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1 mmol/L Brd U抑制成纖維細胞增殖,添加雙抗(100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)預防細菌污染,37℃、5%CO2、91%濕度環(huán)境中培養(yǎng),約每36～48小時換1次培養(yǎng)液,培養(yǎng)3～4 d后使用。

1.3.2 實驗分組 實驗分為空白對照組、HA 30μM/L組、HA 60μM/L組及HA 120μM/L組。

1.3.3 檢測心肌細胞 L-鈣通道α1C、CaM 及 Ry R2m RNA的表達 給藥前12 h更換無血清DMEM/F12培養(yǎng)液,分別將30、60、120μM/L HA與心肌細胞共同孵育15 min后棄含藥培養(yǎng)液,用 D-Hank′s液清洗 2～ 3次。 同時,將 HA 30、60 μM/L組心肌細胞與HA共同孵育的時間增設15、60 min兩個時間點,以期觀察HA對心肌細胞 L-鈣通道α1C、CaM 及Ry R2m RNA表達的動態(tài)變化。分別在培養(yǎng)板內(nèi)加入Trizol提取細胞總RNA,紫外分光光度計A260 nm處測定吸光度,定量RNA濃度。根據(jù)美國基因生物庫的基因核酸序列,選取鳥嘌呤加胞嘧啶(G+C)含量約50%的無發(fā)卡結構,相互間無同源序列兩段特異性保守序列,用Primer Premier5.0軟件設計引物(北京賽百盛生物技術公司進行合成),引物序列見表1。參照Fermentas公司逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)一步法試劑盒說明書操作。取適量PCR反應產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠,100 V/cm凝膠的電壓下電泳。生物電泳圖像分析儀測定擴增大曲線下的吸光度值,計算各樣品的L-鈣通道α1C/-actin、CaM/-actin、Ry R2/-actin。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SAS8.1軟件進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以±s表示。各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

HA對心肌細胞L-鈣通道α1C、CaM及 RyR2 mRNA表達的影響見圖1及表2、3。

表2 HA對心肌細胞L-鈣通道α1C、CaM 及Ry R2 mRNA表達的影響(15 min)

表 3 HA對心肌細胞 L-鈣通道α1C、CaM及 Ry R2 m RNA表達的動態(tài)影響

圖1 瓊脂糖凝膠電泳

3 討 論

Ca2+是心肌細胞最重要的第2信使,在維持心臟正常節(jié)律和興奮-收縮偶聯(lián)中發(fā)揮關鍵作用[12-13]。細胞膜L-鈣通道激活,Ca2+入胞質(zhì)后通過Ca2+/CaM途徑調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度,激活肌質(zhì)網(wǎng)Ry R2,使肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+經(jīng) Ry R2大量進入胞質(zhì),引起細胞收縮[14]。外源性藥物觸發(fā) L-鈣通道、CaM、Ry R2等相關調(diào)控蛋白的基因改變,將可能導致細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào),繼而誘發(fā)嚴重的藥源性心律失常。作者前期研究證實,HA引起的乳大鼠心肌細胞快速性心律失常劑量為6～60μΜ/L,導致心肌細胞出現(xiàn)停搏的劑量大于或等于60μΜ/L,HA與心肌細胞共同孵育5～30 min時細胞的搏動頻率增加最顯著[11]。流式細胞檢測HA引起的心肌細胞內(nèi)游離Ca2+升高多出現(xiàn)在給藥后15 min,說明心肌細胞內(nèi)Ca2+參與了HA所致的心律失常發(fā)生過程。

本研究發(fā)現(xiàn),HA能引起心肌細胞L-鈣通道α1C mRNA高表達,α1C亞基不僅是 L-鈣通道構成Ca2+進入孔道的主要結構,也是細胞內(nèi)Ca2+濃度增高時Ca2+-CaM復合物反饋性調(diào)節(jié)L-鈣通道的位點[15]。α1C mRNA的高水平表達表明在HA作用下,L-鈣通道正處于高度開放狀態(tài),亦提示細胞內(nèi)游離Ca2+正處于較高濃度。Ry R2是細胞肌質(zhì)網(wǎng)鈣釋放入胞質(zhì)的主要通道,正常生理條件下受細胞內(nèi)Ca2+/CaM調(diào)控,介導心肌興奮-收縮偶聯(lián)及維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)。HA能同時增強心肌細胞CaM和Ry R2基因表達量,表明CaM和Ry R2可能也參與了HA所致的心肌細胞內(nèi)“鈣超載”過程。綜合不同劑量(60、30 μΜ/L)、不同作用時間(5、15、60 min)HA 對上述mRNA轉錄水平的影響,發(fā)現(xiàn) L-鈣通道、CaM 和 Ry R2基因的表達量增高與心肌細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的升高相伴發(fā)生,進一步證實HA極有可能通過對上述鈣調(diào)控基因mRNA表達的影響而導致心肌細胞“鈣超載”及后續(xù)心律失常的發(fā)生。

在烏頭堿類天然藥物臨床中毒所致的心律失常中,HA的存在可能是導致其毒性反應的主要物質(zhì)基礎之一。心肌細胞L-鈣通道、CaM與Ry R2等鈣調(diào)控蛋白可能是中毒性心律失常發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。因此,在烏頭堿類天然藥物中毒解救中,干預上述靶點,調(diào)節(jié)、恢復上述基因的正常表達可達到解除中毒性心律失常的目的。

[1] 宋東江,陸滿文,李漢青.烏頭堿類化合物毒理學研究概況[J].中國藥理學通報,1989,5(5):272-273.

[2] 周遠鵬.附子及其主要成分的藥理作用和毒性[J].藥學學報,1983,18(5):394-400.

[3] 駱梅娟,周至安.附子的毒性及臨床應用淺析[J].廣州中醫(yī)藥大學學報,2009,26(5):512-514.

[4] 陳春燕.常用中藥方劑可引起嚴重心律失常[J].重慶醫(yī)學,1994,23(6):370.

[5] 王瑞,劉芳,孫毅坤,等.不同附子炮制品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量的HPLC測定[J].藥物分析雜志,2006,26(10):1361-1363.

[6] 范明威,陳煒璇,卓廉佳,等.腎氣丸“陰中求陽”配伍對方中烏頭堿和次烏頭堿含量的影響[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(5):24-26.

[7] 劉芳,于向紅,李飛,等.HPLC測定附子及其炮制品中3種雙酯型生物堿的含量[J].中國中藥雜志,2006,31(14):1160-1162.

[8] 邊寶林,司南,王宏潔,等.附子單煎以及與浙貝母合煎后烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等有毒成分的含量變化研究[J].中國實驗方劑學雜志,2006,12(4):9-10.

[9] 李志勇,張碩峰,暢洪昇,等.不同炮制時間附子飲片雙酯型生物堿含量變化與飲片安全的相關性研究[J].中國中藥雜志,2009,34(9):1086-1089.

[10]張碩峰.附子中3種雙酯型生物堿的心臟毒效關系及甘草苷的干預作用[D].北京:北京中醫(yī)藥大學,2007.

[11]李志勇,孫建寧,張碩峰.次烏頭堿對乳大鼠原代培養(yǎng)心肌細胞的毒性作用[J].中國藥理學與毒理學雜志,2010,24(4):261-265.

[12]楊曉寧,田宗文,黃煥斌,等.新生大鼠心肌細胞的體外培養(yǎng)[J].解剖學雜志,2005,28(3):361-362.

[13]丁翔,仝識非,秦瑤,等.新生大鼠原代心房肌細胞鈣超載模型的建立[J].重慶醫(yī)學,2010,39(11):1331-1333.

[14]李寧,浦介麟.鈣離子通道基因異常與室性心律失常[J].中國心臟起搏與心電生理雜志,2006,20(1):8-10.

[15]Zuhlke RD,Hudmon A,Schulman H,et al.Molecular basis of calmodulin tethering and Ca2+dependent inactivation of L-type Ca2+channels[J].J Biol Chem,2001,276(33):30794-30802.