北京市藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術審評中心（100053）于泳 薛玲

線性是定量測定體外診斷試劑產品的關鍵指標，也是產品上市前審批的主要內容之一。但目前國內還沒有體外診斷試劑產品線性評價方法的有關標準及明確要求。本文通過參考美國國家臨床實驗室標準委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）制訂的評價方案（EP6-A，定量測量方法的線性評價：一種統(tǒng)計學方法；批準指南）（EP6-A：Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures:A Statistical Approach; Approved Guideline），結合國內的有關法規(guī)及相關標準，摸索出定量測定體外診斷試劑的線性評估方法，即通過多項式擬合驗證線性偏差是否滿足臨床可允許誤差，進而確定產品的線性范圍，在給出線性評估方法的基礎上，文中也對有關的數(shù)學操作程序及統(tǒng)計學方法進行了描述。

1 線性評價方案

線性是指在給定的測量范圍內，使測定結果與樣本中分析物的量直接成比例的能力。本方案采用多項式法進行臨床實驗室定量測定方法的線性評價。多項式線性評價首先假定數(shù)據(jù)組為非線性，并假定在不存在隨機誤差的情況下，數(shù)據(jù)點正好落于一條直線或曲線上。

附表1 樣本配制方案

續(xù)附表1 樣本配制方案

附表2 樣本配制方案

具體的評價方法包括兩部分，第一部分檢驗非線性多項式是否較線性多項式與數(shù)據(jù)更為相符。當非線性多項式較線性多項式更符合時，進行方法的第二部分，評估最適非線性多項式與線性多項式間的差異是否小于預先設定的臨床可允許誤差，同時對測定結果的精密度進行檢驗，以提高統(tǒng)計功效。

2 線性評價方案的總體設計

2.1 評估方案的確定

2.1.1 要確定樣本類型，為避免基質效應對結果的影響，進行線性評價時所選用的樣本應與臨床實驗樣本相似，但不可采用含有對測定方法具有明確干擾作用的樣本，如溶血、脂血、黃疸或含有某些特定藥物的樣本。理想樣本為分析物濃度接近預期測定上限的病人混合血清，可用其他病人樣本將其稀釋為預定濃度。EP6-A中建議應盡可能按以下順序進行樣本種類的選擇：①病人混合血清；②用適當稀釋液稀釋的病人血清；③添加分析物的病人樣本；④用處理過的低濃度物質或處理過的血清物質稀釋的病人血清；⑤商業(yè)質控品/校準品/線性物質；⑥使用生理鹽水稀釋的樣本；⑦稀釋不足或過度稀釋的商業(yè)質控品；⑧水溶液；⑨其他溶劑的溶液。

2.1.2 要確定樣本數(shù)量，EP6-A中針對不同目的給出了建議的樣本數(shù)；建立線性范圍：建議9至11個濃度，每個濃度下重復2至4次；驗證內部方法或修正方法：建議7至9個點，每個濃度重復2至3次；驗證線性范圍在實驗室有效：建議5至7個濃度，每個濃度重復2次；應注意當建立方法的線性范圍時，應有20%到30%的樣本的濃度范圍超出預期的測量范圍，但在可接受的線性響應范圍內。

由于EP6-A中也強調了重復測定的次數(shù)應足以對每一濃度的樣品建立可信的評估。對于某些分析物，在一定的濃度時可能需要3-5次重復測試，并且明確了對不同的濃度采取不同的重復次數(shù)不會對系統(tǒng)的評價產生不利的影響。因此驗證人員可以根據(jù)產品特性對需要的重復測定次數(shù)做出選擇。

2.1.3 根據(jù)確定的樣本濃度數(shù)量制備不同濃度水平的樣本。EP6-A的附錄A中給出了5到11個等間距濃度樣本的參考分配方法（見附表1、續(xù)表1）。為了減少因稱量或復溶樣本時產生的誤差，筆者也認為可以采用將高濃度混合樣本進行倍比稀釋的方法，得到等濃度間隔的不同濃度水平樣本，但采用這種方法時應考慮增加高濃度的樣本數(shù)。附表2給出的采用倍比稀釋方法的9個濃度樣本的參考配制方案，其中9號樣本為高濃度混合樣本，7號樣本為9號樣本倍比稀釋即9號樣本濃度的1/2，6號樣本為7號樣本倍比稀釋，以此類推分別得到5至1號樣本。為了增加高濃度的樣本數(shù)，樣本序號8的高濃度樣本濃度為序號7與序號9樣本濃度之和的一半。

2.2 數(shù)據(jù)分析方法 完成方案設計后，可對樣本進行測試，EP6-A建議所有樣本在一次運行中或幾次間隔很短的運行中隨機測定，實驗最好在一天之內完成。在對測試結果進行數(shù)據(jù)分析前，應檢查數(shù)據(jù)中有無由于偶然差錯引起的離群值（outlier），對實測值和稀釋值進行排序，求每個梯度實測值的平均值、標準偏差及變異系數(shù)，并進一步得到每個實測值與對應均值的偏差，每個均值的偏差應小于等于規(guī)定倍數(shù)的標準偏差。如果均值的偏差大于規(guī)定倍數(shù)的標準偏差，其對應的測試值即為離群值，應補充測試。

應用統(tǒng)計學軟件，選擇實測平均值數(shù)據(jù)作為因變量，梯度數(shù)據(jù)作為自變量。生成回歸模型表、方差分析表、回歸系數(shù)表及多項式回歸的擬合曲線。

在進行線性判斷的同時，須判斷精密度是否符合要求。多項式回歸分析方法要求測量數(shù)據(jù)具有較高的測量精密度，否則會降低統(tǒng)計功效（低功效的統(tǒng)計不能得出正確的線性判斷）。

數(shù)據(jù)精密度檢驗方法見

其中，回歸標準誤差（σ）可利用統(tǒng)計學軟件給出或用

計算得到。公式一中，PctBnd 表示具有臨床意義的臨界相關界值，對大多數(shù)分析物PctBnd取5%，最佳擬合方程的回歸標準誤差：總平均濃度S：樣本數(shù)R：重復測量的次數(shù)C為常數(shù)，可根據(jù)最佳擬合方程的階數(shù)得到。不精密度界值的常數(shù)計算如下。最佳擬合方程的階數(shù)：一階或二階，三階；對應的精密度界值的常數(shù)（C）分別為6.3和6.5。公式2中，yi：各個測量值；p（xi）：最佳擬合方程的擬合值；n：樣本數(shù)乘以重復次數(shù)；d：最佳擬合方程的階數(shù)。

精密度符合要求后，可進行線性的判定。在生成的文件里，可得到擬合的一級多項式，二級多項式，三級多項式。多項式回歸方程：級數(shù)為一級、二級、三級；對應的多項式分別為Y=b0+b1X，Y=b0+b1X+b2X2，Y=b0+b1X+b2X2+b3X3；對應的回歸自由度（Rdf）分別為2、3、4。

根據(jù)EP6-A的方法，檢查對非線性系數(shù)進行t檢驗的Sig，若Sig≥0.05，則對應的非線性系數(shù)等于0。檢驗結果分為以下三種情況：

第一種：對擬合三級曲線的b2和b3進行檢驗，所對應的Sig值均≥0.05，則b2=0；b3=0；此三級曲線不是最佳擬合曲線。對擬合二級曲線的b2進行檢驗，所對應的Sig值≥0.05，則b2=0；此二級曲線不是最佳擬合曲線。因此，此次最佳擬合線性為Y=b0+b1X。稱為臨床標準的線性或一階線性。第二種：對擬合三級曲線和二級曲線的b2或b3進行檢驗，所對應的Sig≤0.05，則非線性系數(shù)≠0；此次最佳擬合不是一級線性。對非一級線性者，須進一步計算最佳擬合曲線與直線的平均差異值（Average deviation from linearity，ADL）。如ADL＜臨界值，判定為臨床可接受的非線性，即二階或三階線性。第三種：如ADL＞臨界值，判定為臨床不可接受的非線性，即非線性。

其中，ADL值可按

進行計算，p(x)：最佳擬合二階或三階方程的擬合值；b0+b1Χ：擬合一階方程的擬合值；S：樣本數(shù)；總測量數(shù)據(jù)的平均值（S1+S2+S3+……+Sn）/n。

根據(jù)是否成線性的結果驗證產品的線性范圍。

綜上所述，筆者參考EP6-A，通過對不同濃度水平樣本的測試，并進行線性評價分析，驗證產品的線性范圍。文中也對有關的數(shù)學操作程序及統(tǒng)計學方法進行了描述，希望可以對定量測定體外診斷試劑產品的上市前審批提供一些參考和幫助。