余有貴，李忠海，黃國(guó)華，李 金，周軍燕

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南 邵陽(yáng) 422004)

發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝-蕨渣菌質(zhì)可溶性膳食纖維的工藝優(yōu)化

余有貴1,2，李忠海1，黃國(guó)華2，李 金2，周軍燕2

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南 邵陽(yáng) 422004)

為了獲得發(fā)酵法制備靈芝-蕨渣菌質(zhì)可溶性膳食纖維的最適工藝參數(shù)，以基質(zhì)蕨渣比例、基質(zhì)含水量和培養(yǎng)溫度為因子，以可溶性膳食纖維得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明：可溶性膳食纖維最適制備條件為基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)84%、基質(zhì)含水量為63%、培養(yǎng)溫度27℃。在此條件下，可溶性膳食纖維得率的預(yù)測(cè)值為13.034%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得可溶性膳食纖維得率為12.885%?；貧w方程的預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值差異不顯著，所得回歸模型擬合情況良好，達(dá)到設(shè)計(jì)要求。在本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件下，以發(fā)酵法制備靈芝-蕨渣菌質(zhì)的可溶性膳食纖維得率(12.885%)顯著高于蕨渣原料的可溶性膳食纖維得率(1.733%)。

蕨渣；靈芝；發(fā)酵工藝；固體菌質(zhì)；可溶性膳食纖維

膳食纖維按其水溶性可分為不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)和可溶性膳食纖維(solubledietary fiber，SDF)兩類，可溶性膳食纖維在許多方面具有比不溶性膳食纖維更強(qiáng)的生理功能[1-2]。因此，制備可溶性膳食纖維具有特別重要的意義。食用菌膳食纖維的主要成分即真菌細(xì)胞壁的主要成分，包括β-葡聚糖、幾丁質(zhì)、半纖維素、甘露糖等[3]。靈芝多糖在靈芝子實(shí)體和菌絲體中都存在[4]，具有免疫調(diào)節(jié)[5-6]、抑制腫瘤[7-8]、延緩衰老[9]、降血脂與抗病毒[10-11]等功效。

蕨(Pteridium aquilinum var. latiusculum Underw.)為蕨科Pteridaceae蕨屬Pteridium植物，在我國(guó)分布廣泛[12]。利用蕨根可加工成蕨粉，大量的蕨渣被棄之不用[13]。然而，鮮見(jiàn)有利用靈芝菌固態(tài)發(fā)酵蕨渣制備菌質(zhì)復(fù)合膳食纖維的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以含膳食纖維豐富而可溶性膳食纖維極低的蕨渣[14]為主要原料，利用靈芝固態(tài)發(fā)酵對(duì)蕨渣膳食纖維進(jìn)行改性[15]，從靈芝-蕨渣菌質(zhì)中提取可溶性膳食纖維。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菌質(zhì)可溶性膳食纖維的發(fā)酵生產(chǎn)條件進(jìn)行優(yōu)化，為制備高產(chǎn)率可溶性膳食纖維提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

靈芝[Ganoderma lucidum(Leyss:Fr.)Karst] GL10購(gòu)自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。

鮮蕨(Pteridium aquilinum var. latiusculum Underw.)根采自邵陽(yáng)市近郊；麩皮 邵陽(yáng)市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

耐高溫α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶 丹麥Novo公司；三羧甲基氨基甲烷 美國(guó) Amresco公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GDE-CSF型膳食纖維測(cè)定儀 意大利Velp公司；KND-HYP8型消化爐、LNK-871型凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；KSW-5-12A型馬弗爐 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；TDL-5Z型離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司。

1.3 可溶性膳食纖維的制備

將鮮蕨根洗凈表面泥沙，破碎、搓洗去淀粉，收集的蕨渣經(jīng)瀝水、60℃烘干、粉碎后，獲得過(guò)80目篩的蕨渣樣品。

以蕨渣為主要原料，輔以少量的麩皮和1%的石膏粉配制固體培養(yǎng)基，裝入大試管(18.5cm×2.5cm)于121℃滅菌30min，接種靈芝菌種后在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，將靈芝培養(yǎng)至開始現(xiàn)蕾時(shí)，取出固體菌質(zhì)，60℃鼓風(fēng)烘干、粉碎、過(guò)80目篩，得到靈芝-蕨渣菌質(zhì)粉。

取一定量的菌質(zhì)粉樣品，分別加入高溫α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶進(jìn)行水解。將酶的水解醪冷卻、4000r/min離心20min得到上清液，用4倍體積的95%乙醇沉淀，傾去上清液，取沉淀物在0.05MPa真空干燥2h，即可得到可溶性膳食纖維產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)基質(zhì)中蕨渣比例、水分含量和培養(yǎng)溫度等對(duì)靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維影響的單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，對(duì)靈芝發(fā)酵蕨渣制備菌質(zhì)中可溶性膳食纖維的工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化。選取基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)、基質(zhì)含水量和培養(yǎng)溫度3個(gè)主要因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，因素水平與編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平與編碼Table 1 Factors and levels in response surface design

1.5 測(cè)定指標(biāo)

水分含量測(cè)定：GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測(cè)定》；灰分測(cè)定：GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測(cè)定》；蛋白質(zhì)測(cè)定：GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；膳食纖維含量測(cè)定[16]：AOAC991.43《膳食纖維的測(cè)定》。

式中：m為SDF產(chǎn)品質(zhì)量/g；ω為SDF產(chǎn)品中的SDF含量/%；m0為菌質(zhì)粉樣品質(zhì)量/g。

1.6 模型的驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化發(fā)酵法制備靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維的生產(chǎn)條件。在優(yōu)化條件下制備可溶性膳食纖維，通過(guò)比較預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值驗(yàn)證模型的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)安排及結(jié)果Table 2 Response surface design scheme and experimental results

按照中心復(fù)合設(shè)計(jì)方案，安排20組處理組合，每個(gè)處理組合設(shè)3個(gè)平行樣，分別測(cè)定各靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率(以絕干質(zhì)量為基準(zhǔn))，結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS9.0軟件進(jìn)行處理[17]。

2.2 回歸模型的建立

通過(guò)分析自變量和因變量得到一個(gè)在給定的范圍內(nèi)預(yù)測(cè)響應(yīng)值的回歸方程。可溶性膳食纖維得率的初步回歸方程如式(1)。

對(duì)回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，決定系數(shù)R2=96.24%，P＜0.01。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the established regression equation

從表3可以看出，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)具有極顯著性(P＜0.01)，交互項(xiàng)具有顯著性(P＜0.05)。失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著(P＞0.05)，說(shuō)明回歸方程與實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合很好。

表4 回歸方程各項(xiàng)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test for each regression coefficient of the established regression equation

對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)(表4)表明，X3以及X12、X22、X32的二次項(xiàng)對(duì)可溶性膳食纖維得率均有極顯著影響(P＜0.01)，其中X3為正效應(yīng)，而X12、X22、X32的二次項(xiàng)均為負(fù)效應(yīng)；X1X2對(duì)靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率有顯著影響(P＜0.05)，為負(fù)效應(yīng)；X2X3對(duì)靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率有顯著影響(P＜0.01)，為正效應(yīng)；X1X3對(duì)靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率的影響不顯著(P＞0.05)。經(jīng)優(yōu)化后的回歸方程為：

經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，決定系數(shù)為R2=95.83%，P＜0.01。表明自變量和因變量之間有極顯著的回歸關(guān)系，說(shuō)明模型可用于靈芝-蕨渣菌質(zhì)提取可溶性膳食纖維得率的預(yù)測(cè)，具有實(shí)際應(yīng)用意義。

2.3 各因素交互作用對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響

在回歸方程式(2)中，固定一個(gè)因素在零水平上，研究另外兩個(gè)因素間的交互效應(yīng)，用SAS9.0編程制作出響應(yīng)面和等高線圖，結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

圖1 基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)與基質(zhì)含水量對(duì)可溶性膳食纖維得率影響的等高線和響應(yīng)曲面Fig.1 Contour plot and response surface plot for the effects of the amounts of destarch bracken roots and water in fermentation medium on SDF yield

由圖1可以看出，當(dāng)把培養(yǎng)溫度固定于零水平時(shí)，隨著基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；隨著基質(zhì)含水量的升高，靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率先快速上升然后陡然下降；曲面的最高點(diǎn)出現(xiàn)在X1∈[－0.5，0.5]，X2∈[－ 0.5，0.5]的區(qū)域內(nèi)。

圖2 基質(zhì)含水量與培養(yǎng)溫度對(duì)可溶性膳食纖維得率影響的等高線和響應(yīng)曲面Fig.2 Contour plot and response surface plot for the effects of water amount in fermentation medium and culture temperature on SDF yield

由圖2可見(jiàn)，當(dāng)把基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定于零水平時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率先迅速上升然后緩慢下降；隨著基質(zhì)含水量的升高，靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率先迅速上升然后迅速下降；曲面的最高點(diǎn)出現(xiàn)在X2∈[－0.2，0.7]，X3∈[－ 0.2，1.1]的區(qū)域內(nèi)。

圖3 基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)與培養(yǎng)溫度對(duì)可溶性膳食纖維得率影響的等高線和響應(yīng)曲面Fig.3 Contour plot and response surface plot for the effects of the amount of destarch bracken roots in fermentation medium and culture temperature on SDF yield

由圖3可見(jiàn)，當(dāng)把基質(zhì)含水量固定于零水平時(shí)，隨著基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率先緩慢上升然后迅速下降；隨著培養(yǎng)溫度的升高，靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率先迅速上升然后緩慢下降；曲面的最高點(diǎn)出現(xiàn)在X1∈[－0.7，0.5]，X3∈[－ 0.5，1.5]的區(qū)域內(nèi)。

2.4 可溶性膳食纖維生產(chǎn)工藝的驗(yàn)證

利用SAS9.0確定各因素水平的最佳取值為X1=－0.179，X2=0.254，X3=0.513，轉(zhuǎn)化為編碼前的水平為：基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)84.11%，基質(zhì)含水量為63.13%，培養(yǎng)溫度27.03℃。其對(duì)應(yīng)的靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率響應(yīng)值為13.034%?？紤]到實(shí)際操作的便利，將靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維生產(chǎn)工藝條件修正為：基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)84%，基質(zhì)含水量為63%，培養(yǎng)溫度27℃。從理論求得的最佳組合未包含在所設(shè)計(jì)的20個(gè)試驗(yàn)處理組合中，為了進(jìn)一步對(duì)該生產(chǎn)條件進(jìn)行驗(yàn)證，以聚丙烯塑料袋(18cm×35cm)裝料(0.5kg/袋，以干料計(jì))接種靈芝菌種，培養(yǎng)至現(xiàn)蕾時(shí)檢測(cè)靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率，做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率為12.885%，誤差為1.235%，與模擬值非常接近，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

在本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件下，采用靈芝菌對(duì)蕨渣固態(tài)發(fā)酵所制備的靈芝-蕨渣菌質(zhì)可溶性膳食纖維得率(12.885%)顯著高于蕨渣原料中的可溶性膳食纖維的得率(1.733%)[14]。因此，采用靈芝菌對(duì)蕨渣進(jìn)行膳食纖維改性的方法是可行的，而且效果良好。

3 結(jié) 論

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)建立的靈芝發(fā)酵蕨渣條件中基質(zhì)蕨渣比例、基質(zhì)含水量、培養(yǎng)溫度與靈芝-蕨渣菌質(zhì)可溶性膳食纖維得率之間的回歸模型高度顯著，可用于生產(chǎn)預(yù)測(cè)。

培養(yǎng)溫度對(duì)靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率有極顯著影響(P＜0.01)，基質(zhì)含水量對(duì)靈芝-蕨渣菌質(zhì)可溶性膳食纖維得率有顯著影響(P＜0.05)，而基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率影響不顯著(P＞0.05)；基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)與基質(zhì)含水量之間的交互作用、基質(zhì)含水量與培養(yǎng)溫度之間的交互作用對(duì)靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率有顯著影響(P＜0.05)，而基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)與培養(yǎng)溫度之間的交互作用對(duì)靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率影響不顯著(P ＞0.05)。

發(fā)酵法制備靈芝-蕨渣菌質(zhì)可溶性膳食纖維時(shí)，優(yōu)化的最適生產(chǎn)工藝條件為：基質(zhì)蕨渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)84%，基質(zhì)含水量為63%，培養(yǎng)溫度27℃。在此條件下，靈芝-蕨渣菌質(zhì)中可溶性膳食纖維得率為12.885%，高于蕨渣原料。表明靈芝固態(tài)發(fā)酵蕨渣生產(chǎn)靈芝-蕨渣菌質(zhì)可溶性膳食纖維的產(chǎn)率較高，具有良好的發(fā)展前景。

[1] THAVA V, JIANG Gaosong, JUDY Y, et al. Dietary fiber profile of barley flour as affected by extrusion cooking[J]. Food Chemistry, 2002,77(1): 35-40.

[2] 婁海偉, 遲玉杰. 擠壓豆渣中可溶性膳食纖維制備工藝的優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2009, 25(6): 285-289.

[3] MANZI P, GAMBELIL L, MARCONI S, et al. Nutirents in edible mushrooms: an inter-species comparative study[J]. Food Chemistry,1999, 65(4): 477-482.

[4] 張衛(wèi)國(guó), 劉欣, 陳永泉. 固態(tài)發(fā)酵靈芝多糖提取液中靈芝多糖的測(cè)定[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2006, 22(4): 232-234.

[5] 林志彬. 靈芝的現(xiàn)代研究[M]. 3版. 北京: 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2007:32-98.

[6] LIN Y L, LIANG Y C, LEE S S, et al. Polysaccharide purified from Ganoderma lucidum induced activation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells by the NF-Band p38 mitogen-activated protein kinase pathways[J]. Journal of Leukocyte Biology, 2005, 78(2):533-543.

[7] NONAK Y, SHIBATA H, NAKAI M, et a1. Anti-tumor activities of angle of Ganoderma lucidum in allogenic and synyeneic tumor-bearing mice[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2006, 70(9): 2028-2034.

[8] 江艷, 王浩, 呂龍, 等. 靈芝孢子粉多糖 Lzps-1 的化學(xué)研究及總多糖的抗腫瘤活性[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 40(4): 347-350.

[9] 王黎, 陳潔, 裴瑞, 等. 靈芝多糖對(duì)鼠失血性休克再灌注血液流變學(xué)和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)臺(tái)急救雜志, 2004, 11(4): 215-217.

[10] DEMIRKAYA S, TOPCUOGLU M A, AYDIN T, et a1. Malondialdehyde glutathioneperoxidase and superoxide dismutase in peripheral blood erythrocytes patients with acute cerebral ischemia[J]. Eur J Neural, 2001,8(1): 4351-4353.

[11] 韋玉芳, 王立升, 覃斐章. 靈芝型優(yōu)良膳食纖維方便食品的研制[J].食品科學(xué), 2009, 30(2): 275-278.

[12] 戴錫玲, 李新國(guó), 吳世福. 中國(guó)食用蕨類植物名錄[J]. 中國(guó)林副特產(chǎn),2003, 18(4): 5-6.

[13] 曹清明, 鐘海雁, 李忠海, 等. 我國(guó)蕨淀粉資源的綜合開發(fā)利用[J].食品研究與開發(fā), 2007, 28(12): 168-169.

[14] 余有貴, 李忠海, 張亞, 等. 酶法提取蕨根膳食纖維的工藝優(yōu)化[J].食品與機(jī)械, 2010, 26(1): 129-132.

[15] 余有貴, 李忠海, 黃國(guó)華, 等. 響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化蕨渣基質(zhì)的靈芝培養(yǎng)條件[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2009, 29(12): 37-42.

[16] LEE S C, PROSKY L, de VRIES J W. Determination of total soluble and insoluble dietary fiber in foods-enzymatic-gravimetric methods, MESTRIS buffer collaborative study[J]. Journal of AOAC International, 1992,75(3): 395-416.

[17] 吳有煒. SAS操作入門[M]. 無(wú)錫: 江南大學(xué)理學(xué)院, 2003: 32-65.

Optimization of Solid-state Fermentation Conditions of Destarched Bracken Roots by Ganoderma lucidum for Production of Soluble Dietary Fiber

YU You-gui1,2，LI Zhong-hai1，HUANG Guo-hua2，LI Jin2，ZHOU Jun-yan2
(1. College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China；2. Department of Biological and Chemical Engineering，Shaoyang University, Shaoyang 422004, China)

Destarched bracken roots were solid-state fermented with Ganoderma lucidum and the fermentation residue was harvested and submitted to enzymatic hydrolysis and subsequent absolute ethanol precipitation to obtain soluble dietary fiber(SDF). The amounts of destarch bracken roots and water in fermentation medium and culture temperature were identified as main factors that influence SDF yield, and optimized by response surface methodology combined with central composite design.The results showed that the optimum amounts of destarch bracken roots and water in fermentation medium and culture temperature were 84%, 63% and 27 ℃, respectively. Under these conditions, the predicted and experimental values of SDF yield were 13.034% and 12.885%, respectively. The fact that they were not significantly different demonstrated that the developed regression model could experimental data well and was qualified. Moreover, the experimental value of SDF yield(12.885%) was significantly higher than the value of 1.733% obtained without Ganoderma lucidum fermentation before enzymatic hydrolysis.

destarched bracken roots；Ganoderma lucidum；fermentation process；solid-sate；soluble dietary fiber

TQ920.4

A

1002-6630(2011)05-0187-05

2010-05-18

余有貴(1964—)，男，教授，博士研究生，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵技術(shù)。E-mail：yufly225@yahoo.com.cn