周國利，郭 彥，方 翔，吳玉厚

(聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059)

雞CAPN1基因多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

周國利，郭 彥，方 翔，吳玉厚

(聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059)

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)(PCR-SSCP)方法對147只壽光雞CAPN1基因第4外顯子進(jìn)行多態(tài)性檢測，分析其與部分肉質(zhì)性狀的關(guān)系。在CAPN1基因第4外顯子上共檢測到3種基因型AA、AB和BB，它們的基因型頻率分別為0.286、0.510和0.204。方差分析結(jié)果表明：在壽光雞群體中，BB基因型個(gè)體的胸肌pHu值顯著高于AA基因型個(gè)體(P＜0.05)；AA基因型個(gè)體的肌內(nèi)脂肪含量顯著高于BB基因型個(gè)體(P＜0.05)。

壽光雞；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)(PCR-SSCP)；CAPN1基因；肉質(zhì)性狀

中國的肉類產(chǎn)量居世界第一，中國肉類加工工業(yè)保持著較快的增長勢頭，肉類總產(chǎn)量年均增長4.8%，尤其由于禽肉口感好，易烹飪，營養(yǎng)豐富，深受人民群眾的歡迎[1]。隨著人民生活水平的不斷提高，人們對禽畜肉產(chǎn)品的要求也有了進(jìn)一步的提高。不僅要求肉品安全，營養(yǎng)豐富，而且要有較好的口感和風(fēng)味。雞肉是重要的禽肉產(chǎn)品之一，其品質(zhì)的優(yōu)劣直接影響到消費(fèi)者對它的接受程度及飼養(yǎng)者和銷售者的經(jīng)濟(jì)利益，因此提高雞的肉質(zhì)品質(zhì)對畜牧業(yè)來說具有非常重要的經(jīng)濟(jì)意義。

鈣蛋白酶(calpain)廣泛存在于各組織，廣泛表達(dá)的鈣蛋白酶有兩種：鈣蛋白酶Ⅰ和鈣蛋白酶Ⅱ，CAPN1是細(xì)胞質(zhì)中主要的蛋白水解酶，在肌原纖維蛋白降解中起著重要的作用[2]。禽類CAPN1基因序列與哺乳動(dòng)物同源性較低，這可能是進(jìn)化上的差異導(dǎo)致的[3]。雞與其他動(dòng)物在各組織中的表達(dá)譜也是有差異的[4]。在活體動(dòng)物中，很多學(xué)者認(rèn)為該系統(tǒng)與動(dòng)物的肌肉生長發(fā)育有關(guān)，而在動(dòng)物宰后與肉的嫩度密切相關(guān)[5-6]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，國內(nèi)外已經(jīng)開始了鈣激活酶系統(tǒng)基因水平的初步研究[7-8]。逐步篩選控制該酶系統(tǒng)的基因，并大幅度增加對其基因多態(tài)性的研究[9]，旨在進(jìn)一步研究鈣激活酶系統(tǒng)在肉成熟嫩化過程中的作用機(jī)理、培育高品質(zhì)畜禽品種。

壽光雞，又叫慈倫雞。壽光雞的特點(diǎn)是體型碩大、蛋大。壽光雞肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)豐富。屬肉蛋兼用的優(yōu)良地方雞種。本實(shí)驗(yàn)以雞CAPN1基因?yàn)槿赓|(zhì)性狀候選基因，對壽光雞CAPN1基因外顯子4進(jìn)行多態(tài)性檢測，并在壽光雞群體中分析其多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以同一條件下飼養(yǎng)9周齡左右的147只壽光雞為材料，翅靜脈采血，抗凝劑抗凝，置于冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室用于DNA的提取。柱式全血基因組抽提試劑盒 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ND-1000紫外-可見分光光度計(jì) NanoDrop公司；高速冷凍離心機(jī) 德國Beckman公司；Alpha ImagerTM2200凝膠成像系統(tǒng) 安瑪西亞公司；PTC-225 PCR儀MJ. Research公司；DYY-2Ⅲ穩(wěn)壓電泳儀 北京市六一儀器廠；C-LM3型嫩度儀由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生產(chǎn)；PHS-25數(shù)顯pH計(jì) 上海智光儀器儀表有限公司。

1.3 肉質(zhì)性狀表型的測定

胸肌和腿肌的pHu值、肌內(nèi)脂肪含量、胸肌和腿肌剪切力、胸肌失水率、胸肌和腿肌蒸煮損失參照趙小玲等[10]和林麗超等[11]的方法測定、肌紅蛋白含量參照Trout等[12]的方法測定。

1.4 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)雞CAPN1基因的DNA序列(GenBank登錄號：NC_006090)，用DNAMan5.0和Oligo6.0結(jié)合設(shè)計(jì)雞CAPN1基因外顯子4的特異引物(包括外顯子4兩側(cè)的部分內(nèi)含子區(qū)域)，引物合成由北京華大基因有限公司完成。引物序列：上游引物：5＇-GGATGCCCTGTTCTGCTC AC-3＇；下游引物：5＇-GGTCGGACTCACTTGGC GTA-3＇，擴(kuò)增片段長180bp左右。

雞血樣基因組DNA的提取用柱式全血基因組抽提試劑盒提取，提取后的DNA用TE緩沖液溶解后，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計(jì)測定濃度后，－20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，其中含有約50ng基因組DNA，10pmol/L的引物，200 μmol/L的dNTPs，1.5mmol/L MgCl2，1.25U Taq酶。樣品經(jīng)94℃變性3min后，按下列程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，34個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR-SSCP多態(tài)性檢測

取2μL PCR產(chǎn)物和5μL的上樣緩沖液(98%甲酰胺、0.025g/100mL溴酚藍(lán)、0.025g/100mL二甲苯氰、10mmol/L EDTA(pH8.0))置于PCR管中，離心混勻，98℃變性10min，迅速插入冰中，放置10min，使之保持變性狀態(tài)。樣品用12% 非變性聚丙烯酰胺(V丙烯酰胺:V甲叉雙丙烯酰胺=29:1)凝膠電泳進(jìn)行檢測。電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染顯帶。拍照，進(jìn)行基因型分析并記錄結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

基因頻率和基因型頻率分析：采用Popgene Version

1.31軟件進(jìn)行分析。

雜合度(heterozygosity，He)表示群體在某座位為雜合子的比例，反映群體遺傳變異程度的大小[13]。由等位基因頻率計(jì)算雜合度，群體內(nèi)某一座位的雜合度計(jì)算如式(1)。

式中：i為第i個(gè)等位基因；pi為第i個(gè)等位基因的頻率；n為等位基因數(shù)。

有效等位基因數(shù)(effective number of allele，Ne)也是反映群體遺傳變異大小的一個(gè)指標(biāo)，它表明等位基因在群體中分布越均勻，有效等位基因數(shù)越接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)。其值為純合度的倒數(shù)[14]。

多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)值是根據(jù)其等位基因在一個(gè)群體中的頻率來計(jì)算的，表示位點(diǎn)多態(tài)性高低[15]。

式中：pi和pj分別為第i個(gè)和第j個(gè)等位基因的頻率；n為等位基因數(shù)。

線性模型建立：構(gòu)建了最小二乘分析模型來分析所發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點(diǎn)與肉質(zhì)性狀指標(biāo)的關(guān)系。其一般線性模型為：

式中：Yij為性狀的觀察值；μ為群體平均值；Genotypei為第i種標(biāo)記基因型的固定效應(yīng)；eij為隨機(jī)殘差效應(yīng)。用SPSS11.0的一般線性模型(general liner model，GLM)過程完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

圖1 CAPN1基因外顯子4的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified products for the exon 4 of CAPN1 gene

用設(shè)計(jì)的引物分別對不同個(gè)體雞的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對引物的擴(kuò)增片段與目的片段大小一致，長度大約為180bp，目的條帶清晰(圖1)，特異性好，可直接用于SSCP 分析。

表1 壽光雞CAPN1外顯子4的群體遺傳學(xué)參數(shù)Table 1 Population genetic parameters of exon 4 in Shouguang chicken

2.2 PCR-SSCP檢測結(jié)果

圖2 CAPN1基因外顯子4的PCR-SSCP電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of PCR-SSCP for the exon 4 of CAPN1 gene

對147只壽光雞擴(kuò)增產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)CAPN1基因第4外顯子含有3種不同基因型，分別命名為AA、AB和BB。

2.3 PCR-SSCP遺傳多態(tài)性分析

從表1可以看出，在壽光雞群體中，該座位共發(fā)現(xiàn)了AA、AB和BB 3種基因型，AB基因型個(gè)體占絕大多數(shù)，AA和BB基因型個(gè)體數(shù)量基本相當(dāng)。而A和B兩個(gè)等位基因的出現(xiàn)的頻率基本上是一致的。多態(tài)信息含量為0.373，屬于中度多態(tài)，有效等位基因數(shù)為1.987，觀察雜合度略高于期望雜合度。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

2.4 PCR-SSCP多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的分析

表2 CAPN1基因外顯子4不同基因型肉質(zhì)性狀的最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)差(±s)Table 2 Least squares mean and standard deviation for meat quality traits in Shouguang chicken with different genotypes of CAPN1 gene (±s)

表2 CAPN1基因外顯子4不同基因型肉質(zhì)性狀的最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)差(±s)Table 2 Least squares mean and standard deviation for meat quality traits in Shouguang chicken with different genotypes of CAPN1 gene (±s)

注：同一行數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P＜0.05)；pHu.屠宰24h后的pH值。

性狀 基因型AA AB BB胸肌pHu 6.05±0.36b 6.20±0.37ab 6.34±0.37a腿肌pHu 6.43±0.40 6.36±0.74 6.41±0.53肌紅蛋白含量/(μmol/g)2.04±1.04 2.03±0.82 2.00±0.84肌內(nèi)脂肪含量/% 4.95±0.95a 3.73±0.72ab 2.67±0.56b胸肌剪切力/N 16.07±2.12 15.68±1.98 16.46±1.01腿肌剪切力/N 16.37±2.54 16.46±2.08 16.66±1.76胸肌失水率/% 6.56±1.57 6.59±1.99 7.22±1.91胸肌蒸煮損失/% 20.85±5.27 21.31±4.36 22.69±4.02腿肌蒸煮損失/% 20.15±4.56 21.01±4.02 22.32±3.92

通過構(gòu)建最小二乘線性模型，分析了CAPN1基因外顯子4的多態(tài)性與壽光雞肉質(zhì)性狀的關(guān)系。從表2可知，在壽光雞群體中，BB基因型個(gè)體的胸肌pHu值顯著高于AA基因型個(gè)體(P＜0.05)；AA基因型個(gè)體的肌內(nèi)脂肪含量顯著高于BB基因型個(gè)體(P＜0.05)。其他性狀指標(biāo)在不同基因型之間差異不顯著。

3 討 論

關(guān)于CAPN1基因在不同雞品種中的多態(tài)性研究，最近有了一些報(bào)道，研究表明CAPN1在不同雞品種(系)中都存在多態(tài)性[16-17]。但本實(shí)驗(yàn)率先分析壽光雞群體CAPN1基因第4外顯子的SSCP多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)壽光雞群體在該座位存在3種基因型(AA、AB和BB)和兩個(gè)等位基因(A和B)，A和B兩個(gè)等位基因的頻率基本相當(dāng)。所研究的壽光雞群體在該座位處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，這說明壽光雞的人工選育程度是非常低的。

Botstein等[15]提出了衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量參數(shù)，當(dāng)PIC＞0.50時(shí)，該基因座位為高度多態(tài)基因座；0.25＜PIC＜0.50時(shí)為中度多態(tài)基因座；PIC＜0.25時(shí)為低度多態(tài)基因座。有效等位基因數(shù)是基因純合度的倒數(shù)，反映了等位基因的相互影響，也可作為群體遺傳變異的一個(gè)參數(shù)。Hines等[14]指出等位基因在群體中分布越均勻，有效等位基因數(shù)就越接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)。雜合度反映群體在多個(gè)基因座上的遺傳變異，一般認(rèn)為它是度量群體遺傳變異的一個(gè)最適參數(shù)[13]。據(jù)此，在CAPN1基因外顯子4的實(shí)驗(yàn)中，可得出它的多態(tài)性程度屬于中度多態(tài)，有效等位基因數(shù)接近觀察等位基因數(shù)，雜合度也較高。這說明壽光雞群體的遺傳多樣性較高，該品種具有較大的選擇潛力。高海軍等[18]采用PCR-SSCP方法對清遠(yuǎn)麻雞的CAPN1基因外顯子4部分序列、內(nèi)含子4和外顯子5部分序列進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析，共檢測到AA、AB、AC、BB、BC和CC 6種基因型，在該多態(tài)座位上的PIC為0.5909，為高度多態(tài)，雜合度水平也較高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

對?；蜓芯堪l(fā)現(xiàn)，在該基因的第316位和530位的氨基酸發(fā)生突變，并且與牛的嫩度呈顯著相關(guān)，并且這兩個(gè)標(biāo)記在商業(yè)中已經(jīng)被評估或應(yīng)用[19-21]。在雞的群體中，關(guān)于準(zhǔn)確影響肉質(zhì)性狀的標(biāo)記還不是非常明確，研究者也正在進(jìn)行大量的研究來尋找影響雞肉質(zhì)性狀的相關(guān)標(biāo)記[22-24]。本研究結(jié)果表明壽光雞CAPN1基因外顯子4的PCR-SSCP多態(tài)性位點(diǎn)與雞的胸肌pHu值和肌內(nèi)脂肪含量等性狀都有一定的相關(guān)。CAPN1基因外顯4座位中的BB基因型個(gè)體的胸肌pHu值顯著高于AA基因型個(gè)體(P＜0.05)，這表明對肉品的貨架壽命來說BB基因型是優(yōu)勢基因型。AA基因型個(gè)體的肌內(nèi)脂肪含量顯著高于BB基因型個(gè)體(P＜0.05)，而且肌內(nèi)脂肪含量與肉的嫩度程正相關(guān)。許多報(bào)道顯示，肌內(nèi)脂肪含量對肉食用品質(zhì)有積極的影響，肌內(nèi)脂肪對肉的嫩度、多汁性和風(fēng)味特性均具有改善作用。從這個(gè)角度來說，AA基因型對于肉質(zhì)嫩度、多汁性和風(fēng)味特性具有一定改善作用，但是否會(huì)滿足不同消費(fèi)群體的需求，還需根據(jù)不同的育種目標(biāo)來進(jìn)行確定如何進(jìn)行選擇。

總之，CAPN1基因外顯子4在壽光雞的群體中遺傳變異程度較高，而與壽光雞的部分肉質(zhì)性狀存在一定的關(guān)聯(lián)性，可以初步使用該多態(tài)性位點(diǎn)(CAPN1-Exon4)對壽光雞的部分肉質(zhì)性狀進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇。

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Polymorphism of CAPN1 Gene and Its Correlation with Meat Quality Traits in Shouguang Chicken

ZHOU Guo-li，GUO Yan，F(xiàn)ANG Xiang，WU Yu-hou
(College of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng 252059, China)

Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) method was used to determine the polymorphism of exon 4 of CAPN1 gene in 147 Shouguang chicken, and analyze the correlation between CAPN1 gene and meat quality traits in Shouguang chicken. Three genotypes were identified as AA, AB and BB with the genotype frequencies of 0.286,0.510 and 0.204, respectively. Statistical analysis indicated that type BB Shouguang chicken had significantly higher breast muscle pHu value than type AA (P＜0.05). However, type AA Shouguang chicken had significantly higher content of intramuscular fat than type BB (P＜0.05).

Shouguang chicken；PCR-SSCP；CAPN1 gene；meat quality traits

S831.2；R393.11

A

1002-6630(2011)05-0207-04

2010-06-22

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2007D33)

周國利(1975—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)榉肿舆z傳學(xué)與動(dòng)物育種。E-mail：glzhou1975@163.com