楊軍，張馳

（南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院國家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，南京210028）

乳源性金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測與基因分型

楊軍，張馳

（南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院國家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，南京210028）

通過檢驗(yàn)各類乳制品收集了大量乳源性金葡菌菌株，應(yīng)用酶聯(lián)熒光免疫分析法對菌株的腸毒素進(jìn)行檢測分析，并進(jìn)一步使用熒光定量PCR法對腸毒素基因進(jìn)行分型。結(jié)果表明，乳源性金葡菌腸毒素的檢出率與基因型分布均呈現(xiàn)一定顯著特征，應(yīng)用酶聯(lián)熒光免疫分析法與熒光定量PCR法對腸毒素的檢測結(jié)果總體無顯著性差異。

乳源性金黃色葡萄球菌；腸毒素；酶聯(lián)熒光免疫；熒光定量PCR；基因分型

0 引言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，簡稱金葡菌）是導(dǎo)致人類食物中毒與化膿性感染的最主要病原體之一[1]。乳及乳制品是金葡菌主要食品宿主，我國生奶中金葡菌的污染率一般在15%～30%之間，奶酪、酸奶等乳制品中金葡菌的檢出率也一直居高不下[2，3]。在金葡菌的眾多毒力因子中，葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal Enterotoxin,SE）是導(dǎo)致食物中毒的關(guān)鍵因素。如不計(jì)類腸毒素，SE可分為多種血清型，除20世紀(jì)60年代確認(rèn)的5種（SEA-SEE）外，近年又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)6種，即SEG–SEI,SER–SET[4-6]。金葡菌腸毒素的檢測與分型對乳品質(zhì)量控制與安全預(yù)警具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究將對大量乳品中的腸毒素進(jìn)行檢測分析，并首次應(yīng)用熒光定量PCR法對產(chǎn)腸毒素菌株進(jìn)行高通量快速血清分型，探索金葡菌腸毒素檢測與分型的新方法。

1 材料及方法

1.1 儀器與試劑

自動(dòng)酶聯(lián)熒光分析儀（Mini-VIDAS），熒光定量PCR儀（ABI 7500 Fast），水浴搖床，高速離心機(jī)（Sigma3-18K）。

VIDAS Staph enterotoxin II檢測試劑條，SYBR Premix EX Taq試劑盒，細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒，培養(yǎng)基；溶菌酶，引物；化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳品的檢測與菌株的收集

將國家乳制品專項(xiàng)監(jiān)督抽查中的生奶、巴氏殺菌乳、酸奶、奶酪等乳品，應(yīng)用國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.10《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》的方法，即質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的NaCl肉湯培養(yǎng)基增菌、選擇性培養(yǎng)、血漿凝固酶試驗(yàn)的流程，對其中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢驗(yàn)。分別統(tǒng)計(jì)每種乳品中金葡菌的污染比率，收集并凍存所得到的乳源性金黃色葡萄球菌。

1.2.2 乳源性金葡菌腸毒素的檢測

將凍存的乳源性金黃色葡萄球菌菌株于3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的NaCl肉湯培養(yǎng)基中37℃振搖培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)液以5 000 r/min離心5 min以沉淀菌體，取上清液0.5 mL檢測其中的金葡菌腸毒素。在mini-VIDAS儀器上按照檢測腸毒素的程序進(jìn)行設(shè)定后，分別將培養(yǎng)上清液、陽性對照液、陰性對照液加入試劑條的加樣孔內(nèi)，運(yùn)行熒光酶聯(lián)免疫分析程序，儀器即可自動(dòng)檢測培養(yǎng)上清液中的腸毒素。mini-VIDAS試劑條整合了可特異性結(jié)合SEA-SEE的多克隆抗體，其定性檢測結(jié)果以“陰性”或“陽性”表示。

1.2.3 乳源性金葡菌腸毒素的血清型分型

根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的各腸毒素基因序列sea-see，seg-sei,ser-set，設(shè)計(jì)用于金黃色葡萄球菌這11中腸毒素基因檢測的SYBR GREEN熒光定量PCR引物，擴(kuò)增片段的大小介于73-195 bp之間。具體的引物序列見表1。將所有凍存的乳源性金黃色葡萄球菌菌株于3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的NaCl肉湯培養(yǎng)基中37℃振搖培養(yǎng)過夜后，使用細(xì)菌基因組快速提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，并測定其OD260與OD280驗(yàn)證其濃度與純度。使用TE緩沖液將基因組DNA稀釋至1 g/L用于腸毒素的熒光定量PCR分型。按照SYBR Premix EX Taq試劑盒說明書配制20 μL PCR反應(yīng)體系，包含SYBR Premix EX Taq 10.0 μL，濃度為10 μmol/L擴(kuò)增引物各0.4 μL，ROX染料0.4 μL，DNA模板2 μL，滅菌雙蒸水6.8 μL。應(yīng)用ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀的SYBR GREEN模式進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95℃（30 s）、40個(gè)循環(huán)的95℃（3 s）加60℃（25 s）。反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)定一個(gè)溶解曲線記錄循環(huán)以考察引物的特異性。當(dāng)擴(kuò)增曲線的Ct值小于35時(shí)即判定相應(yīng)的腸毒素基因型陽性，計(jì)算每種腸毒素基因型在乳源性金黃色葡萄球菌中出現(xiàn)的比率。表1為用于檢測11種腸毒素血清型的引物序列及其擴(kuò)增片段。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS11軟件提供的卡方檢驗(yàn)比較分析mini-VIDAS法和SYBR GREEN熒光定量PCR法檢測乳源性金葡菌腸毒素SEA-SEE在所有菌株中出現(xiàn)的頻率。

2 結(jié)果與討論

2.1 金黃色葡萄球菌的檢測與菌株收集

使用國家乳品標(biāo)準(zhǔn)中以培養(yǎng)和生化鑒定為基礎(chǔ)的金黃色葡萄球菌檢測方法，以血漿凝固酶陽性為判定依據(jù)，對多種乳制品中金黃色葡萄球菌進(jìn)行了檢測分析。共檢測來自江蘇26家乳品企業(yè)的生奶228份、巴氏殺菌乳134份、酸奶104份、奶酪78份，金葡菌的檢出率分別為生奶18%（42份陽性）、酸奶6%（6份陽性）、奶酪5%（4份陽性），巴氏殺菌乳金葡菌未檢出。從上述陽性樣品中各分離一株金葡菌，共收集并保存52株乳源性金葡菌菌株。

2.2 乳源性金葡菌腸毒素的檢測

使用mini-VIDAS法對上述所有乳源性金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)腸毒素情況進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，在52株菌株中，有22株為腸毒素陽性，占42%。即在所收集的乳源性金葡菌中，有近一半菌株可產(chǎn)SEA-SEE中的至少一種。

2.3 乳源性金葡菌腸毒素的分型

將收集的52株乳源性金葡菌菌株分別擴(kuò)增后，提取其基因組DNA，使用SYBR GREEN熒光定量PCR法對每一菌株基因組中的sea-see，seg–sei，ser–set基因進(jìn)行鑒定。除對照孔外，在同一塊96孔擴(kuò)增板上可同時(shí)進(jìn)行8個(gè)菌株的這11種腸毒素基因的檢測，檢測在45 min內(nèi)完成，典型的擴(kuò)增曲線與溶解曲線如圖1所示。由圖1可以看出，無論針對何種腸毒素血清型，陽性菌株均呈現(xiàn)明顯的擴(kuò)增反應(yīng)，溶解曲線的Tm值在72～82℃之間，表明本研究設(shè)計(jì)的針對11種金葡菌腸毒素基因的檢測引物特異性良好。52株金葡菌菌株中，各腸毒素血清型的陽性率如表2所示。由表2可以看出，除新近報(bào)道的ses和set外，其余9種腸毒素基因型在乳源性金黃色葡萄球菌菌株中均有分布。與以往大量文獻(xiàn)報(bào)道的食品種的金葡菌腸毒素以sea為主不同[2，3,7]。本研究收集的乳源性金葡菌中，傳統(tǒng)的5種腸毒素血清型sea-see以sed最為常見，陽性率顯著高于其他4種血清型；其他血清型中，seg和sei作為腸毒素基因簇（egc）的組成基因，其出現(xiàn)頻率顯著高于其他腸毒素血清型。

表1 引物序列及其擴(kuò)增片段

表2 乳源性金葡菌11種腸毒素基因分型結(jié)果

圖1 11種腸毒素血清型的擴(kuò)增和溶解曲線

2.4 兩種方法檢測金葡菌腸毒素的比較

應(yīng)用mini-VIDAS法對乳源性金葡菌腸毒素SEASEE檢測的陽性率為42%，而應(yīng)用熒光定量PCR法檢測金葡菌腸毒素基因sea-see的陽性率為48%，均低于文獻(xiàn)報(bào)道的源自臨床病例和其他食品中的金葡菌菌株中腸毒素的陽性率。經(jīng)逐一對比，有3株金葡菌為VIDAS檢測陰性，但熒光定量PCR法檢出其至少包含一種sea-see基因，表明金葡菌自身的腸毒素基因的表達(dá)水平需達(dá)到VIDAS檢測的閾值才能被之檢出，這與國外文獻(xiàn)報(bào)道的最新研究結(jié)論相符[7]。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，應(yīng)用mini-VIDAS與熒光定量PCR法對金葡菌腸毒素SEA-SEE或其基因的檢出率總體無顯著性差異（P＞0.05），表明2種方法具備相似的可信度。

3 結(jié)論

（1）各類乳制品中的金葡菌檢出率以生奶最高，酸奶和奶酪中也均有檢出。使用熒光酶聯(lián)免疫分析對52株乳源性金葡菌腸毒素的檢測表明，近半數(shù)的菌株為產(chǎn)腸毒素菌株，低于來自臨床病例和其他食品中的金葡菌菌株腸毒素的陽性率。

（2）使用熒光定量PCR法對52株乳源性金葡菌基因組中目前已知的11種腸毒素基因進(jìn)行快速分型，結(jié)果表明大多數(shù)腸毒素基因型在乳源性金葡菌中均有分布。與來源于臨床病例的菌株不同的是，乳源性菌株中腸毒素以sed和腸毒素基因簇基因（seg和sei）為主。

（3）盡管應(yīng)用熒光酶聯(lián)免疫分析與熒光定量PCR法分析腸毒素基因在少數(shù)乳源性菌株中出現(xiàn)了基因檢測陽性而未檢出毒素蛋白的情況，但統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)表明兩種方法對于腸毒素SEA-SEE或其基因的檢測結(jié)果無顯著差異。

總之，本研究是對乳源性金葡菌關(guān)鍵致病因子腸毒素的檢測與分型的首次探索，發(fā)現(xiàn)了乳源性金葡菌金葡菌腸毒素基因型分布的新特征，并對腸毒素檢測的熒光酶聯(lián)免疫分析與熒光定量PCR法進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法評(píng)價(jià)。此外，本研究首次建立的熒光定量PCR法對金葡菌腸毒素快速分型方法，相比于以往文獻(xiàn)報(bào)道采用的定性PCR與電泳檢測的方法，將分型速度與檢測通量提高了4-10倍，安全性也具有顯著優(yōu)勢，將為乳品安全控制和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供新的技術(shù)支持。

[1] ARVIDSON S,TEGMARK K.Regulation of Virulence Determinants in Staphylococcus aureus[J].Int.J.Med.Microbiol,2001,291(2):159-70.

[2] 徐勤，巢國祥.生牛奶中金黃色葡萄球菌污染狀況及耐藥性狀研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15（8）：972-973.

[3] 巢國祥，焦新安，周麗萍，等.食源性金黃色葡萄球菌流行特征、產(chǎn)腸毒素特性及耐藥性研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16（8）：904-907.

[4] MARRACK P,KAPPLER J.The Staphylococcal Enterotoxins and Their Relatives[J].Science,1990,248(1):705-711.

[5] OMOE K,IMANISHI K,HU D L,et al.Characterization of Novel Staphylococcal Enterotoxin-Like Toxin Type P[J].Infect Immun,2005,73(1):5540-5546.

[6] ONO H K,OMOE K,IMANISHI K,et al.Identification and Characterization of Two Novel Staphylococcal enterotoxins Types S and T[J].Infect Immun,2008,76(2):4999-5005.

[7] PEREIRA V,LOPES C,CASTRO A,et al.Characterization for Enterotoxin Production,Virulence Factors,and Antibiotic Susceptibility of Staphylococcus aureus Isolates from Various Foods in Portugal[J].Food Microbiol,2009,26(1):278-282.

Detection and serological type identification of enterotoxins in dairy-derived Staphylococcus aureus

YANG Jun,ZHANG Chi
(Nanjing Insititute of Supervision&Testing on Product Quality,Nanjing 210028,China)

In the present study,we collected dairy-derived S.aureus strains in the inspection of various dairy products,and then examined the enterotoxin production of the isolates using enzyme-linked fluorescent assay(mini-VIDAS).Further,Real-time PCR analysis was performed to identify 11 of enterotoxin serological types in these strains.The frequency of enterotoxin-positive isolates presented unique characteristics,as well as the distribution of enterotoxin serological types.In addition,there was no significant difference between the test results of enterotoxin in dairy-derivedS.aureususing VIDAS assay and Real-time PCR.

dairy-derivedStaphylococcus aureus;enterotoxin;enzyme-linked fluorescent assay;Real-time PCR;serological type identification

Q939.9，TS252.7

A

1001-2230（2011）03-0014-03

2010-12-15

楊軍（1971-），男，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測。