呂慧超，熊宇生，劉倫倫，夏延斌

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128）

提高嗜酸乳桿菌在豆乳中發(fā)酵性能的研究

呂慧超，熊宇生，劉倫倫，夏延斌

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128）

測(cè)定了嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵豆乳的單菌產(chǎn)酸曲線與混菌產(chǎn)酸曲線，并采用正交實(shí)驗(yàn)分析了它們對(duì)發(fā)酵豆乳的品質(zhì)影響及與單菌發(fā)酵豆乳貯存期質(zhì)量變化的比較。結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌是影響酸豆乳質(zhì)量的主要因素，嗜熱鏈球菌次之。按體積分?jǐn)?shù)為2.2%嗜酸乳桿菌、體積分?jǐn)?shù)為3.0%保加利亞乳桿菌、體積分?jǐn)?shù)為1.8%嗜熱鏈球菌配比共同發(fā)酵，可得到組織狀態(tài)、口感風(fēng)味較好的酸豆乳，克服了單一嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆乳產(chǎn)酸慢、凝乳時(shí)間長、活菌數(shù)不高且貯存期活菌數(shù)下降快的缺陷。

豆乳；嗜酸乳桿菌；發(fā)酵性能

0 引言

豆乳，又稱豆奶，是一種營養(yǎng)豐富的傳統(tǒng)食品，含優(yōu)質(zhì)大豆蛋白、大豆異黃酮、多種維生素和礦物質(zhì)，并且不含膽固醇。但在中國市場(chǎng)上，豆奶產(chǎn)品似乎一直在牛奶和豆?jié){的夾縫中生存[1]。發(fā)酵豆乳是以豆乳為原料，加入少量奶粉或某些可供乳酸菌利用的糖類作為發(fā)酵促進(jìn)劑，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而生產(chǎn)的酸性豆乳飲料[2]，改善了豆乳風(fēng)味的同時(shí)也為其健康發(fā)展提供了出路。

嗜酸乳桿菌是一種腸道益生菌，被視為“第三代酸乳發(fā)酵劑菌種”[3]。其發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)特性較差，凝乳時(shí)間較長，產(chǎn)品口感風(fēng)味也有一定缺陷[4,5]。我國對(duì)嗜酸乳桿菌的研究卻還處在起步階段，與其它乳酸菌的混合發(fā)酵目前研究較少，即使有也僅限于工藝方面的研究。關(guān)于其與其它乳酸菌在豆乳中混合發(fā)酵還沒有深入的研究報(bào)道。因此，探索乳酸菌在豆乳中的發(fā)酵性能對(duì)設(shè)計(jì)豆乳發(fā)酵劑以及制定發(fā)酵工藝甚至產(chǎn)品工藝都是非常重要的。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

大豆；蔗糖；無糖脫脂奶粉；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，La），由保健品中分離；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgarious，Lb)；嗜熱鏈球菌（Streptoccous themophilus，St)。

活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：總菌數(shù)以MRS培養(yǎng)基計(jì)數(shù)，嗜酸乳桿菌菌數(shù)以山梨醇-MRS培養(yǎng)基計(jì)數(shù)。

豆乳培養(yǎng)基：選豆(挑選表面光澤無霉?fàn)€變質(zhì)的大豆)——浸泡(0.25%的Na2CO3和KCl按1︰1，常溫浸泡10 h左右）——磨漿去渣(將浸泡好的大豆用熱水中浸泡10 min，撈出于磨漿機(jī)中磨漿，濾渣收取豆?jié){)——均質(zhì)(25 MPa,10 min)——?dú)⒕?121℃，15 min)——室溫冷卻備用制得大豆乳培養(yǎng)基。

脫脂乳培養(yǎng)基按乳粉︰水=1︰8復(fù)原，121℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 評(píng)價(jià)方法

感官評(píng)價(jià)：本研究由20個(gè)經(jīng)過酸乳感官評(píng)價(jià)培訓(xùn)的人組成小組，對(duì)酸豆乳按表1進(jìn)行感官評(píng)價(jià)；正交實(shí)驗(yàn)中，綜合評(píng)分=酸度（30%）+感官評(píng)分（40%）+活菌數(shù)評(píng)分（30%）。

表1 感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)

1.2.2 酸度滴定

準(zhǔn)確吸取搖勻的待測(cè)樣品10 mL，加20 mL蒸餾水混合均勻，滴加2滴酚酞，用濃度為0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，用消耗的NaOH體積乘以10即得酸度值。

1.2.3 菌種馴化

按豆乳體積分?jǐn)?shù)為0%，10%，30%，60%，90%，100%逐步增大的方法制備豆乳馴化培養(yǎng)基，將在脫脂乳中活化好的菌種先分別接種于10%馴化培養(yǎng)基中，待其凝乳后再轉(zhuǎn)接入該濃度豆乳中，經(jīng)過幾次馴化直到其凝乳時(shí)間縮短至6～8 h，再將其轉(zhuǎn)接至下一濃度豆乳培養(yǎng)基中，如此直到每種菌完全適應(yīng)豆乳環(huán)境的生長。馴化培養(yǎng)過程中，若發(fā)現(xiàn)凝乳時(shí)間增長或有乳清析出，及時(shí)分離菌種復(fù)壯，再進(jìn)行下一步的馴化。

1.2.4 耐酸實(shí)驗(yàn)

采用MRS液體培養(yǎng)基，用濃度為0.1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值分別為l.0，2.0，3.0，4.0，模擬胃酸環(huán)境。然后接種相同量經(jīng)MRS液活化好的嗜酸乳桿菌菌種，將原液（pH值為6.5）與四組實(shí)驗(yàn)組共同放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，馬上拿出用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，72 h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。存活率=lgn1/lgn0·100%，其中l(wèi)gn1為不同pH梯度的活菌數(shù)(對(duì)數(shù)值)，lgn0原液中的活菌數(shù)（對(duì)數(shù)值）[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單菌產(chǎn)酸曲線測(cè)定

將充分活化的嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌分別以體積比（以下同）為8%的接種量接入豆乳培養(yǎng)基中，每隔2 h測(cè)定1次酸度，繪制單菌產(chǎn)酸曲線，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，由于豆乳培養(yǎng)基中含有氨基酸、糖類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，所以菌種隨發(fā)酵時(shí)間的延長，產(chǎn)酸量不斷增加，開始時(shí)La產(chǎn)酸速度是最快的，但6 h以后Lb產(chǎn)酸最快且最終產(chǎn)酸量最高，其次是La。St產(chǎn)酸速度最慢，且產(chǎn)酸量最低。實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，La和Lb發(fā)酵豆乳基本無豆腥味及其他異味，且Lb凝乳最快，由此可增大Lb在混合菌種中的比例進(jìn)行發(fā)酵。

2.2 混菌產(chǎn)酸曲線的測(cè)定

以嗜酸乳桿菌為主發(fā)酵菌種，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌為輔發(fā)酵菌種，將充分活化好的3種菌分別以La+Lb,La+Lb+St,La+St混合菌種（均按體積比為1︰1的比例）模式，按體積分?jǐn)?shù)為8%的接種量接入純豆乳培養(yǎng)基中，于40℃恒溫箱中培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定一次酸度，繪制混菌產(chǎn)酸曲線如圖2所示。

圖2 混菌產(chǎn)酸曲線的測(cè)定

由圖2可以看出，La+Lb混合發(fā)酵豆乳產(chǎn)酸速度是最快的，且最終酸度在70°T以上，達(dá)到了酸奶制品所需酸度要求（通常在70°T-90°T之間）。La+Lb+St產(chǎn)酸速度次之，但兩者相差不大，而La+St產(chǎn)酸最慢且最終酸度遠(yuǎn)低于所需酸度要求?？梢奓a與Lb兩者在豆乳中有一定的互生效應(yīng)，其共生機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。但考慮到La+Lb+St與其產(chǎn)酸相差不大，且3種菌共同發(fā)酵組織狀態(tài)和氣味都較好，因此選用3種菌共同發(fā)酵。

2.3 馴化前后混菌發(fā)酵產(chǎn)酸曲線測(cè)定

將馴化前后的菌種分別按La︰Lb︰St=1︰1︰1的比例，接入（接種量8%）純豆乳錐形瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)接到實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)條件與方法同單菌產(chǎn)酸曲線測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 馴化前后混菌發(fā)酵產(chǎn)酸曲線

由圖3可以看出，未馴化的菌種發(fā)酵豆乳雖然能使其凝乳，但凝乳時(shí)間長，且最終酸度低于70°T。由圖比較可以看出，馴化前菌種酸度達(dá)到70°T需要20 h，而馴化后的菌種只需12 h左右，即縮短了8 h;凝乳時(shí)間也從原來的16 h縮短到了8 h?？梢婑Z化后的菌種比未馴化的菌種產(chǎn)酸速度明顯增快且最終產(chǎn)酸量增加，約增加了21.7%。通過活菌計(jì)數(shù)還發(fā)現(xiàn)，各種菌活菌數(shù)均達(dá)到108，與未馴化的相比均有一定程度的增加。

2.4 3種菌對(duì)發(fā)酵豆乳質(zhì)量影響正交實(shí)驗(yàn)

采用馴化后的菌種，采用k(3 3)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表（因素水平見表2），在40℃條件下恒溫培養(yǎng)發(fā)酵8 h，然后置于4℃冰箱中冷藏后熟24 h,進(jìn)行相關(guān)評(píng)價(jià)與測(cè)定。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。菌種優(yōu)選實(shí)驗(yàn)后熟時(shí)酸度、乳酸菌數(shù)、感官評(píng)分及其綜合評(píng)分的極差分析結(jié)果如表4所示。

表2 菌種優(yōu)選實(shí)驗(yàn)因素水平

表3 菌種優(yōu)選實(shí)驗(yàn)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 極差分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：3種菌發(fā)酵豆乳時(shí)，對(duì)乳酸菌總菌數(shù)的影響最大的是La，其次是St，三者的影響次序?yàn)長a＞St＞Lb；對(duì)后熟時(shí)酸度影響的主要因素是Lb＞La＞St；對(duì)感官評(píng)分影響最大的是La,Lb次之，最后是St,即La＞Lb＞St,并且隨著A、B因素的增加，有利于風(fēng)味的提高。3個(gè)因素對(duì)于酸豆乳綜合評(píng)分也就是質(zhì)量影響大小為La＞Lb＞St,即嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌是影響豆乳發(fā)酵的主要因素，在豆乳中發(fā)酵性能較好，而嗜熱鏈球菌次之。

2.5 馴化后的嗜酸乳桿菌耐酸實(shí)驗(yàn)

人體胃酸環(huán)境pH值通常在2以下，但隨食物攝入的稀釋作用可上升至3.5左右。嗜酸乳桿菌進(jìn)入人體后，首先要抵御胃酸環(huán)境[7]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了pH值為1～4的MRS液，以模擬胃酸環(huán)境，測(cè)得菌種存活率如圖4所示。

由圖4可以看出，在pH值為3和4的環(huán)境中，嗜酸乳桿菌都能保持較高的活菌數(shù)，達(dá)到90%以上，而pH值為2時(shí)存活率下降到了85%，此時(shí)活菌數(shù)量級(jí)為107；pH值等于1時(shí)存活率更是下降到57.3%，其活菌數(shù)量級(jí)也由原液的109降低到105。由此可以看出，pH值越低，活菌數(shù)下降越快。嗜酸乳桿菌能發(fā)揮保健效果的劑量不應(yīng)該低于106mL-1或106g-1，攝入食物后，胃酸環(huán)境通常在2以上，故馴化后的嗜酸乳桿菌能發(fā)揮其保健作用。

2.6 混菌發(fā)酵乳與單菌發(fā)酵品貯存期間質(zhì)量變化

在相同條件下培養(yǎng)La+Lb+St(接種量為La2.2%,Lb3.0%,St1.8%)混菌發(fā)酵豆乳（A)和單純La(接種量為7%)發(fā)酵豆乳（B），待其凝乳后，取出置于4℃冰箱中，每隔兩天取樣進(jìn)行酸度、活菌總數(shù)測(cè)定及感官評(píng)價(jià)，結(jié)果如表5所示。

圖4 馴化后嗜酸乳桿菌耐酸試驗(yàn)

表5 最佳組合結(jié)果

2.6.1 感官特征比較

由上表可以看出，隨著貯存時(shí)間的延長，酸豆乳的酸度不斷增加，但在正常貯存期內(nèi)不超過100°T，在一定程度上有助于酸豆乳風(fēng)味的提高。用混合菌種發(fā)酵的酸豆乳比用單一嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆乳效果好，且發(fā)酵質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。A第8 d開始有乳清析出，B第4 d就開始出現(xiàn)，并且析出量均隨時(shí)間的延長而增多。

2.6.2 酸度變化情況

A種酸豆乳第4 d至第8 d是酸度增加最快的時(shí)候，第10 d后酸度增加較緩慢。從整體上來看，A酸豆乳酸度上升較B慢，而酸度上升慢更有利于酸豆乳風(fēng)味的提高和乳酸菌活力的保持，故A種酸豆乳更適合工業(yè)上生產(chǎn)。

2.6.3 活菌數(shù)測(cè)定

從表中可以看出，A和B中活菌數(shù)都隨時(shí)間的延長而呈下降趨勢(shì)，第8 d之后下降得尤為快速，第12天后又趨于平緩，但基本上都有108個(gè)數(shù)量級(jí)。A中嗜酸乳桿菌數(shù)14 d時(shí)存活數(shù)還有0.21×108mL-1，達(dá)到了的保健效果劑量。但B中嗜酸乳桿菌活菌數(shù)明顯下降，且第10 d數(shù)量級(jí)已降低到106。故利用3種菌混合發(fā)酵明顯優(yōu)于嗜酸乳桿菌單菌發(fā)酵。

3 結(jié)論

（1）測(cè)定了3種菌在酸豆乳中單菌產(chǎn)酸情況和混菌產(chǎn)酸情況，利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵，可提高嗜酸乳桿菌在豆乳中的活菌數(shù)和貯存期菌種活力，并且能夠縮短發(fā)酵時(shí)間，提高最終產(chǎn)酸量。

（2）通過正交實(shí)驗(yàn)分析了3種菌對(duì)發(fā)酵豆乳質(zhì)量的影響,結(jié)果表明嗜酸乳菌、保加利亞乳桿菌是影響發(fā)酵豆乳質(zhì)量的主要因素，嗜熱鏈球菌次之。

（3）探索出最佳菌種比例La為2.2%，Lb為3.0%，St為1.8%，可得到品質(zhì)較好的發(fā)酵豆乳，且最終活菌數(shù)可達(dá)108個(gè)數(shù)量級(jí)，比單一嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆乳具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

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Study on improving the fermentation performance of Lactobacillus acidophilus in soybean milk

LV Hui-chao，XIONG Yu-sheng，LIU Lun-lun，XIA Yan-bin
（College of Food Science and Technology,Hunan Agriculture University,Changsha 410000,China)

In this study,Single curves and the mixed lactic acid bacteria acid production curves of Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus bacteria fermented soybean milk were determined.By using the cross-experimental analysis method,their impact on the quality of fermented soybean milk were studied.Also,the quality changes of mixed bacteria and single-strain fermented soybean milk were compared during storage period.The results shows that Lactobacillus acidophilus,Lactobacillus bulgaricus are the main factors in fermented soybean milk,followed by Streptococcus thermophilus;In accordance with the proportion of 2.2%Lactobacillus acidophilus,3.0%Lactoba cillusbulgaricusand1.8%Streptococc-us thermophilus to co-ferment soybean milk,we can get organized state and good taste,which overcomes the defects of single Lactobacillus acidophilus in fermented soybean milk that produce acid slowly,curd for a long time,not high number of viable cells and fast-decreasing viable cells during storage period.

soybean milk；Lactobacillus acidophilus；fermentation performance

TS252.54

A

1001-2230（2011）03-0038-04

2010-12-15

呂慧超（1990-），女，本科，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇l(fā)酵。通訊作者：夏延斌