楊 帥,陳立偉,顧海莎,蔡天明(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

DMF降解菌MBYD-1的分離、鑒定及降解特性

楊 帥,陳立偉,顧海莎,蔡天明?(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

從農(nóng)藥廠污水處理池的活性污泥中分離得到一株能以二甲基甲酰胺(DMF)為唯一碳、氮源生長的菌株MBYD-1.經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及 16S rRNA基因序列分析,將菌株初步鑒定為假單胞菌屬 (Pseudomonas sp.).菌株 MBYD-1降解 DMF的最適條件為:pH 7.0,30℃.當(dāng)DMF濃度為400mg/L,接種量為2%時(shí),菌株能在72h內(nèi)將DMF完全礦化.底物廣譜性實(shí)驗(yàn)表明,菌株MBYD-1能在甲酸鹽和甲醛中很好地生長,在甲酰胺中的生長情況優(yōu)于二甲胺.

二甲基甲酰胺；假單胞菌；生物降解；底物廣譜性

二甲基甲酰胺(DMF)是一種性能優(yōu)良的有機(jī)溶劑和主要的精細(xì)化工原料,廣泛應(yīng)用于聚氨酯合成革工業(yè)及醫(yī)藥、農(nóng)藥、石油化工行業(yè)等.美國已確定 DMF為人體可能致癌物質(zhì)[1-5].中國每年僅合成革工業(yè)排放的DMF廢水就達(dá)到1億t左右[6],對環(huán)境造成了嚴(yán)重污染.國內(nèi)學(xué)者對DMF廢水的處理主要采用物理化學(xué)方法,如胡湖生等[7]用的萃取—吸附法、劉志國等[8]采用的堿性水解法和Fenton氧化法、蒸餾法等,但此類方法成本較高.由于微生物對土壤和水環(huán)境中的難降解化合物的降解起著關(guān)鍵作用,采用生物方法處理DMF工業(yè)廢水具有高效率、低成本的優(yōu)勢.因此,篩選能夠降解 DMF的微生物資源必然會(huì)對DMF工業(yè)廢水的高效處理具有促進(jìn)作用.

目前已報(bào)道的能夠降解DMF的微生物菌株主要是以下幾個(gè)屬的細(xì)菌:Ochrobactrum[9],Pseudomonas[10-11],Alcaligenes[12],Paracoccus[13-17].但國內(nèi)尚鮮見對DMF降解菌的篩選、分離及其特性進(jìn)行探討的報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)分離到1株以DMF為唯一碳源、氮源生長的高效降解菌,并對其降解特性進(jìn)行了研究,以期為 DMF污染的生物降解提供理論依據(jù)和菌株資源.

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

二甲基甲酰胺(DMF)為國藥集團(tuán)DMF分析純藥劑,純度含量≥99.5%.無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L):NaCl 1.00,K2HPO42.50,KH2PO41.00,pH 7.0,以DMF作為唯一碳源、氮源(無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂粉).

LB 培養(yǎng)基(g/L):酵母膏 5.00,蛋白胨 10.00,NaCl 10.00(固體LB培養(yǎng)基加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂粉),pH 7.0.

1.2 菌株的分離

按 5%的接種量接種經(jīng)過馴化的污泥至100mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(DMF濃度為400mg/L)的三角瓶中, 于30℃、160r/min下振蕩培養(yǎng)1周.按10%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的DMF無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)1周,連續(xù)轉(zhuǎn)接5次.取0.5mL富集液作梯度稀釋,取10-2～10-8稀釋度的液體各 0.1mL涂布于 DMF無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上,30℃培養(yǎng).挑取單菌落劃線分離.純化后的菌株轉(zhuǎn)接至 DMF濃度為 400mg/L的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,于30℃、160r/min下培養(yǎng)3d后,通過高效液相色譜(HPLC)檢測其降解效果.

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 降解菌株的培養(yǎng)特征及生理生化鑒定將降解菌采用平板涂布法接種于LB固體培養(yǎng)基上,30℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài).并用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察菌體形態(tài),參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]進(jìn)行生理生化鑒定.

1.3.2 抗生素抗性測試 將一定濃度的菌懸液涂布于帶有抗生素的 LB固體培養(yǎng)基上,抗生素濃度分別為20和50mg/L,30°C培養(yǎng)24h,以菌體的生長狀況作為敏感性或耐藥性的判定標(biāo)準(zhǔn).選用的抗生素有氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素、氯霉素、紅霉素和慶大霉素.

1.3.3 降解菌株16S rRNA基因序列分析 采用SDS高鹽沉淀法[19]提取菌體總 DNA.16S rRNA基因采用通用引物[20]進(jìn)行PCR擴(kuò)增,上游引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ (Escherichia coli bases 8 to 27),下游引物為 5′-TACCTTGTTACGACTT-3′(Escherichia coli bases 1507 to 1492).PCR設(shè)定程序?yàn)?94℃預(yù)變性 5min;94℃變性1min,50℃退火1 min,72℃延伸1.5min,共30個(gè)循環(huán);最后 72℃終延伸 20min[21],4℃保存.PCR產(chǎn)物回收采用試劑盒回收,與pMD19-T Vector連接后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α中,提質(zhì)粒驗(yàn)證,將質(zhì)粒正確的轉(zhuǎn)化子送Invitrogen公司測序.測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中核酸序列比對,并采用MEGA 4.0軟件NJ方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4 檢測方法

DMF含量采用 HPLC(FL2200-1江蘇福立分析儀器有限公司)檢測,色譜柱為Ultimate C18;流動(dòng)相為甲醇/乙酸銨溶液＝體積比 1/9[22],乙酸銨溶液濃度為 0.02mol/L用超純水配置,流動(dòng)相使用前過 0.45μm 濾膜并脫氣 20min,流速為1.0mL/min;檢測波長為 210nm.測試樣品需經(jīng)0.45μm 濾膜過濾,進(jìn)樣量為 20μL,以保留時(shí)間定性,外標(biāo)法定量.

氨氮采用納氏試劑比色法測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選與鑒定

圖1 菌株MBYD-1在LB平板上的菌落照片和電鏡照片(×20000)Fig.1 The colony of strain MBYD-1 on LB plate and the electronic photograph(×20000)

經(jīng)分離純化,得到 1株能以 DMF為唯一碳源、氮源生長的細(xì)菌,該菌株命名為 MBYD-1.MBYD-1在固體LB培養(yǎng)基上生長時(shí),菌落直徑大小為 1～2mm,呈規(guī)則圓形凸起,乳白色,有光澤,較黏稠(圖 1a).菌體革蘭氏染色陰性、無芽孢、短桿狀、極生鞭毛(其電鏡圖片見圖 1b).菌株MDYD-1不能水解淀粉,不能液化明膠;V.P.實(shí)驗(yàn)、M.R實(shí)驗(yàn)均呈陰性;接觸酶、氧化酶、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、檸檬酸利用實(shí)驗(yàn)均為陽性;對氨芐青霉素、氯霉素和紅霉素都具有抗性,對鏈霉素、卡那霉素較為敏感,對慶大霉素最為敏感(表1).

以菌株總 DNA為模板,采用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增,獲得1.5kb大小的PCR產(chǎn)物,用Blastn程序?qū)⒃撈螠y序結(jié)果和GenBank中已登錄的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較,發(fā)現(xiàn)菌株 MBYD-1與Pseudomonas plecoglossicida FPC951(T)同源性為 98.928%.根據(jù)生理生化結(jié)果及序列特征,將菌株 MBYD-1鑒定為 Pseudomonas sp.,其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2.

表1 菌株MBYD-1對抗生素的抗性Table 1 The antibiotic tolerance of strain MBYD-1

圖2 菌株MBYD-1基于16S rRNA基因序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain MBYD-1 based on the 16S rRNA gene homology

2.2 菌株以 DMF為唯一碳氮源的生長及對DMF的降解

在DMF濃度為400mg/L的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,以 2%的接種量接入種子液,于 30℃、160r/min搖床培養(yǎng).每12h取樣,測定DMF濃度、OD600nm及氨氮的釋放量(圖3).由圖3可見,菌株能夠以DMF為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長,菌體在最初的24h內(nèi)對DMF降解緩慢,隨著時(shí)間的推移,在24h以后菌體呈現(xiàn)快速生長態(tài)勢,同時(shí)DMF也開始迅速降解,在60h左右菌體生長速度放緩,并在72h左右達(dá)到最大值并趨于平穩(wěn),同時(shí)DMF也在此時(shí)完全降解.在整個(gè)降解過程中伴隨著NH4+-N的釋放,在60h左右時(shí)NH4+-N的釋放量達(dá)到最大值,大約釋放出理論氨氮釋放值的89%.

2.3 DMF起始濃度對菌株降解的影響

在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入DMF,使其終濃度分別為 50,100,200,300,400,500mg/L.以 2%的接種量接入MBYD-1種子液,于30℃、160r/min搖床培養(yǎng),每隔一段時(shí)間取樣,測定 DMF的濃度(圖 4).由圖 4可見,菌株對濃度在 500mg/L以內(nèi)的DMF在84h內(nèi)都可以完全降解,濃度越低降解時(shí)間越短.在反應(yīng)初期,DMF對菌株的降解有一定的抑制作用,而低濃度時(shí)抑制作用相對較弱,DMF的初始濃度越高,受抑制的時(shí)間越長,然而當(dāng)抑制期結(jié)束后,菌株完全適應(yīng)了生長環(huán)境,高濃度DMF可為其提供更充足的營養(yǎng)物質(zhì)以從事生命活動(dòng)并大量繁殖.

圖3 菌株MBYD-1以DMF為唯一碳氮源的生長狀況Fig.3 Utilization of DMF as sole carbon and nitrogen sources for growth by strain MBYD-1

圖4 DMF初始濃度對菌株降解DMF的影響Fig.4 Effect of initial DMF concentration on its degradation by strain MBYD-1

2.4 接種量對菌株降解DMF的影響

在DMF濃度為400mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,以 0.25%,1%,2%,5%,10%,15%的接種量接入MBYD-1種子液,于 30℃、160r/min搖床培養(yǎng),每 12h取樣,測定 DMF濃度(圖 5).由圖 5可見,增大接種量明顯加快降解速度,而且在反應(yīng)初期,也減短了 DMF對菌株的抑制作用,可以讓菌株更快進(jìn)入對 DMF的快速降解階段,當(dāng)接種量為2%時(shí),抑制時(shí)間比接種量為0.25%時(shí)縮短了12h,但是當(dāng)接種量大于2%時(shí)再增大接種量對縮短抑制時(shí)間影響不大,當(dāng)接種量大于 5%時(shí)對整體降解速度的提高也影響不大.

圖5 接種量對菌株降解DMF的影響Fig.5 Effect of inoculation on DMF degradation by strain MBYD-1

2.5 pH值對菌株降解DMF的影響

圖6 pH值對菌株降解DMF的影響Fig.6 Effect of pH on DMF degradation by strain MBYD-1

調(diào)整pH值為5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,并加入相應(yīng) pH值下的緩沖體系以保證在降解過程中 pH值保持不變,在 DMF濃度為400mg/L左右的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,以2%的接種量接入MBYD-1種子液,于30℃、160r/min搖床培養(yǎng) 60h,測定 DMF濃度(圖 6).由圖 6可見,菌株MBYD-1的pH適應(yīng)范圍為6.5～8,在pH＜6時(shí)菌株對DMF的降解情況較差,pH7.0時(shí)菌株對DMF的降解活性最高,降解率在86%左右,當(dāng)pH＞8時(shí),降解率明顯下降.

圖7 溫度對菌株降解DMF的影響Fig.7 Effect of temperature on DMF degradation by strain MBYD-1

2.6 溫度對菌株降解DMF的影響

在DMF濃度為400mg/L左右的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,以2%的接種量接入MBYD-1種子液,置于不同溫度的搖床中,160r/min恒溫培養(yǎng) 60h,測定DMF濃度(圖7).由圖7可見,溫度對菌株降解效果影響較為顯著,在 25～30℃范圍內(nèi)降解率隨溫度升高而顯著增加,降解率從42%提升到88%.菌株降解 DMF的最佳溫度為 30℃.降解率達(dá)到88%,在較低溫度 20℃和較高溫度 40℃時(shí),降解率分別為23%和59%.

2.7 菌株MBYD-1底物廣譜性測試

為了研究菌株能否利用DMF可能降解的中間產(chǎn)物,在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入初始濃度200mg/L的二甲胺、甲胺、甲酰胺、甲酸鹽作為唯一碳源,以NH4Cl為氮源,于30℃、160r/min搖床培養(yǎng)72h,分時(shí)取樣測定OD600nm值(圖8).由圖8可見,菌株在甲酸鹽中的生長最好,因?yàn)楦鶕?jù)Ghisalba等[23-24]研究報(bào)道,雖然DMF中有3個(gè)C原子,但是其中并無C-C鍵, DMF更易降解為類似于1個(gè)碳原子的化合物,且甲酸鹽是DMF的代謝途徑的末端產(chǎn)物.在甲酰胺中的生長優(yōu)于二甲胺中的生長.

圖8 菌株MBYD-1利用不同碳源的生長情況Fig.8 growth of strain MBYD-1 on alternative carbon sources

3 結(jié)論

3.1 分離到1株能以DMF為唯一碳氮源生長并將其降解的假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)細(xì)菌,菌株號為:MBYD-1.

3.2 菌株 MBYD-1降解 DMF的最適溫度為30℃,pH值為7.0.

3.3 菌株 MBYD-1能在 72h內(nèi)完全降解400mg/L的DMF,并釋放出氨氮,釋放量為理論氨氮釋放量的89%.

3.4 菌株 MBYD-1能在甲酸鹽中很好的生長,在甲酰胺中的生長情況優(yōu)于二甲胺.

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Isolation, identification and degradation characteristics of a DMF-degrading bacterial MBYD-1.

YANG Shuai, CHEN Li-wei, GU Hai-sha, CAI Tian-ming?(College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China). China Environmental Science, 2011,31(3)：

A bacterial strain MBYD-1, capable of utilizing DMF (N, N-dimethylformamide) as sole carbon and nitrogen source, was isolated from activated sludge collected from wastewater-treating system of a pesticide manufacturer. This strain was identified as Pseudomonas sp. according to its morphological, physiological and biochemical analysis and the analysis of its 16S rRNA gene sequence, and named strain MBYD-1. The optimal pH and temperature for the degradation were 7.0 and 30℃, respectively. Strain could mineralize DMF completely in 72 hours when the initial concentration of DMF was 400 mg/L, and with 2% inoculating quantity. Degradable substrates test showed that strain MBYD-1 grew better in formate than formaldehyde, and grew better in formamide than dimethylamine.

N, N-dimethylformamide(DMF)；Pseudomonas sp.；biodegradation；degradable substrates test

X172

A

1000-6923(2011)03-0437-06

2010-07-22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30970099);江蘇省省級環(huán)保科技項(xiàng)目(2009001)

* 責(zé)任作者, 副教授, ctm@njau.edu.cn

楊 帥(1985-),男,安徽馬鞍山人,碩士,主要從事污水生化處理和環(huán)境微生物方向研究.