東北農業(yè)大學資源與環(huán)境學院 ■ 郭建全 徐鳳花 李金 趙忠寶 杜俊杰

一 引言

近年來，生物產甲烷技術因其具有廢物資源綜合利用和凈化環(huán)境的雙重功效而備受關注[1]。目前國內沼氣發(fā)酵以中、高溫為主，低溫研究尚處探索階段，一些研究者認為低于20℃沼氣發(fā)酵速度將急劇降低[2～3]。我國北方地區(qū)池溫在25℃以上僅有3個月，其余時間的戶用沼氣池平均池溫在8～25℃，達不到中、高溫發(fā)酵溫度。若冬季進行沼氣發(fā)酵，加熱、保溫措施會增加成本[3]，因此選育能在低溫下高效產氣的菌株及復合菌系具有重要意義。

由于產甲烷古菌的分離培養(yǎng)十分困難，從應用角度來看選育產甲烷復合菌系是一個更好的選擇。本文以低溫厭氧活性污泥為出發(fā)樣品，利用溫度對微生物的選擇作用，獲得一組穩(wěn)定的低溫、高效產甲烷復合菌系，并研究了溫度對復合菌系產甲烷活性的影響，以期為低溫沼氣發(fā)酵提供微生物資源。

二 材料與方法

1 樣品來源

厭氧污泥、稻田灌溉渠污泥等不同厭氧生境的樣品。

2 培養(yǎng)基質

(1)培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L)：NH4Cl 1.0；MgCl2·7H2O 0.1；K2HPO4·3H2O 0.1；KH2PO4·3H2O 0.2；胰蛋白胨1；酵母膏1；乙酸鈉2；甲酸鈉2；L-半胱氨酸鹽0.5。

維生素液(mg/L)：生物素2；葉酸2；鹽酸吡哆醇10；鹽酸硫胺素5；核黃素5；D-泛酸鈣5；維生素B12 0.1；硫辛酸5；對氨基苯甲酸5；煙酸 5。

微量元素(mg/L)：MgSO4·7H2O 3.0；NaCl 10；MnSO4·2H2O 0.5；FeSO4·7H2O 0.1；CoCl20.1；H3BO30.01；CuSO4·5H2O 0.01；ZnSO40.1；AlK(SO4)2·12H2O 0.01；CaCl2·2H2O 0.1；NaMoO4·2H2O 0.01。

(2)酸化液

取自東北農業(yè)大學工程學院正在運行的沼氣發(fā)酵罐中。

3 試驗方法

(1)試驗裝置及儀器

倒置熒光相差顯微鏡、島津GC2010氣相色譜、發(fā)酵反應器。

試驗裝置由本實驗室根據(jù)改良亨蓋特厭氧技術設計而成，如圖1所示。以250mL的廣口瓶作為反應容器，倒置的量筒收集氣體。整個反應體系置于恒溫培養(yǎng)箱中，同時，用KHCO3調節(jié)每組反應物的初始pH值，使pH值為7.5±0.1。反應的周期為30d，在這個周期內，每一組的甲烷生成基本停止。

(2)低溫產甲烷復合菌系的篩選

將100mL產甲烷菌富集培養(yǎng)液分裝到圖1的反應器中驅氧、滅菌備用。再加入30mL馴化樣品，三次重復，14.0±0.5℃培養(yǎng)，定期通過排水法測定產氣量，氣相色譜測CH4含量。將產氣量、CH4含量高的培養(yǎng)物繼代培養(yǎng)，直至獲得性能穩(wěn)定的菌群。

(3)不同溫度對復合菌系產氣效果的影響

試驗溫度設6℃、10℃、14℃、18℃、22℃、26℃、30℃7個水平，3次重復，間隔一天測定產氣量和甲烷含量，直到產氣終止。

(4)復合菌系應用效果研究

以酸化液作為發(fā)酵原料，物料濃度為8%，設置四組試驗，復合菌系的接種量分別設為5%、10%、15%按體積百分比進行接種，以接種5%的沼液為對照(CK)，培養(yǎng)溫度14±0.5℃、pH調整為7.0，發(fā)酵周期30d。發(fā)酵過程中每天用排水法測定產氣量，氣相色譜測定甲烷含量作為研究指標。

以酸化液作為發(fā)酵原料，初始發(fā)酵液的底物濃度分別設為4%、8%、16%、20%按質量百分比配制，在14±0.5℃、pH調整為7.0下進行30d的發(fā)酵，其他操作同上。

4 分析方法

(1)產甲烷復合菌系形態(tài)觀察

熒光顯微鏡(DM4000B,德國Leica公司)、S-3400N掃描電子顯微鏡。

(2)氣相末端發(fā)酵產物的測定

用島津14C型氣相色譜分析氣體組分。TCD檢測器，TDX-01不銹鋼填充柱，氮氣作為載氣，流速為30 mL/min，進樣口溫度、柱溫、檢測器溫度分別是80℃、80℃、100℃。

以外標法確定CH4標準曲線，氣體檢測環(huán)境為25℃。確定峰高與CH4體積含量的關系為y=0.4038x?0.0168，R2=0.9973。

(3)溫度對產甲烷活性抑制程度的表示方法

以累計甲烷產量Q作為判定溫度梯度對綜合生物活性Am的影響指標，計算公式[4]為：

式中：Am為復合菌系的綜合生物活性指標；Qt、Qc分別為考察系和對照系的累計甲烷產量(產氣量×甲烷純度)以26℃作為對照組。

相應地復合菌系受到溫度抑制程度表達式為：

當溫度抑制解除后，在恢復階段復合菌系的生物活性為：

式中：AM為復合菌系恢復后的綜合生物活性指標；QT、QC分別為恢復期間考察系、對照系的累計甲烷產量。

(4)統(tǒng)計分析

試驗期間測定CH4、CO2及產氣量所得數(shù)據(jù)以SPSS(17.0)中的單因素方差分析及Duncan氏多重比較進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05作為差異顯著的水平。

5 產氣量的測定

產氣量采用自行設計排水裝置(見圖1)。

三 分析與討論

1 復合菌系的篩選

以CH4、CO2含量及15d累計產氣量為指標，從馴化的樣品中選育出一組甲烷含量高、產氣量穩(wěn)定的復合菌系。

圖2表明隨著傳代次數(shù)的增加，CH4含量明顯提高，從第4代開始達到50%以上，第6代達到最高為63.3%，較樣品提高386.0%，之后處于穩(wěn)定保持在60%以上。伴隨著CH4含量的提高CO2含量則迅速降低，經SPSS分析，馴化過程中CH4和CO2含量呈極顯著負相關(P＜0.05)。

15d累計產氣量隨著傳代次數(shù)的增加也持續(xù)上升，1～5代產氣量急劇增加，第5代15d時累計產氣量達到最高為139mL，較馴化前提高了18.7%，經單因素方差分析達到顯著水平(P＜0.05)，之后產氣量穩(wěn)定在132mL左右。傳代過程中CH4含量及產氣量提高與產甲烷古菌數(shù)量在富集過程中迅速增多結果一致(見圖3)。產甲烷古菌有CO2、甲酸、乙酸、甲醇等多種營養(yǎng)類型，據(jù)此可以推斷復合菌系中產甲烷古菌多為CO2營養(yǎng)型。

產甲烷古菌細胞內有兩種特有的F420和F430輔酶，能在一定波長范圍內產生藍綠色熒光，因此熒光數(shù)量一定程度可以反映產甲烷古菌的數(shù)量[5]。

由圖3可以看出，馴化前后復合菌系中產甲烷古菌的熒光數(shù)量及亮度有明顯差異，馴化后熒光數(shù)量及亮度遠大于馴化前，說明馴化對復合系中產甲烷古菌的富集有明顯作用?，F(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的專性嗜冷產甲烷古菌多為甲烷八疊球菌。通過熒光顯微照片和電鏡照片(圖3)可以看到，馴化后復合菌系中桿菌數(shù)量減少，球菌數(shù)量增多并以八疊球菌為主。

2 溫度對復合菌系日產氣量及甲烷含量的影響

溫度是影響沼氣發(fā)酵的重要因素。在沼氣發(fā)酵過程中35～55℃為高溫發(fā)酵，25～35℃為中溫發(fā)酵，低于25℃為低溫發(fā)酵。低溫產甲烷古菌包括專性和兼性嗜冷菌。最適、最低、最高生長溫度低于25℃、10℃、30℃的為專性嗜冷產甲烷古菌；最低生長溫度低于10℃，但可在30～40℃下生長則為兼性嗜冷產甲烷古菌[7]。

從圖4不同溫度下日產氣量的變化動態(tài)中可以看出，復合菌系在14、18、22℃時啟動時間均為9d，啟動后日產氣量在10mL以上持續(xù)了14d，26℃處理啟動時間為7d，10mL以上日產氣量為8d。隨著發(fā)酵進行各處理日產氣量先增加后降低，26℃時第13d達到最高為21.4mL，而14、18、22℃處理均在第15d達到高峰，分別為41.3、40.6、38.6mL，較26℃分別提高93.0%、89.7%和80.3%，單因素方差分析達到極顯著水平(P＜0.05)。多重比較顯示14、18、22℃不同發(fā)酵時間日產氣量差異不顯著(P＞0.05)，6、10、30℃在整個發(fā)酵周期日產氣量變化差異不顯著(P＞0.05)。

表1 產甲烷測定指標與溫度T的二次回歸方程(Y=aT2+bT+c)

溫度對復合菌系甲烷含量的影響如圖5所示。從圖5可以看出，復合菌系26℃處理第9d甲烷含量開始穩(wěn)定，平均值穩(wěn)定在41.6%，14、18、22℃培養(yǎng)時甲烷含量則在第11d達到穩(wěn)定，平均值分別穩(wěn)定在62.1%、61.7%、60.9%，分別較26℃提高49.2%、48.3%、46.4%，單因素方差分析均達到顯著水平(P＜0.05)，但多重比較顯示14、18、22℃甲烷含量均值差異不顯著(P＞0.05)。6、10、30℃處理在整個發(fā)酵周期甲烷含量差異不顯著(P＞0.05)，這是由于溫度可以通過影響產甲烷古菌的酶活性進而影響其產氣能力。

利用產氣量和CH4含量與溫度的關系建立二次回歸方程見表1。根據(jù)回歸方程計算得出，溫度在13.83℃和21.71℃復合菌系分別具有最大的CH4含量及產氣量，因此13.0～22.0℃為該復合系的最適溫度。表明該復合菌系能夠在低溫范圍內正常產氣并且產氣指標均達到中、高溫戶用沼氣發(fā)酵水平[8～9]。

3 不同溫度對復合菌系發(fā)酵周期累計甲烷產量的影響

從圖6中可以看出，當溫度分別為14、18、22℃時，對產甲烷有促進作用，三者的產氣量分別較26℃提高120.6%、93.9%和74.5%。當培養(yǎng)溫度為6、10℃時，對產甲烷有抑制作用。抑制作用主要發(fā)生在反酵的中后期，累計甲烷產量下降了50.7%、17.7%，當培養(yǎng)溫度達到30℃時產甲烷活性下降68.7%。

根據(jù)式(1)～式(3)計算出不同溫度條件下復合菌系的綜合生物活性、抑制程度及恢復過程中綜合生物活性值。由表2可知，將一直由6、10℃處理的復合菌系置于14±0.5℃進行恢復性培養(yǎng)，其綜合活性和一直在14±0.5℃條件下培養(yǎng)的綜合活性值相同，但是30℃恢復后的綜合活性值和受抑制時相比保持不變。表明6、10℃處理14±0.5℃條件培養(yǎng)時，產甲烷具有可恢復性，而30℃處理則不能恢復。

表2 綜合生物活性、抑制程度及恢復后綜合生物活性值

其原因是適宜的溫度范圍可以提高產甲烷活性，增加累計甲烷產量。但是超過最適溫度范圍時產甲烷古菌細胞內酶活、蛋白質和核酸會產生不可逆的變性，或者破壞了細胞的其他成分，導致抑制甚至致死作用，從而降低了產甲烷活性[10]。

根據(jù)定義推斷，復合菌系中的微生物多為專性嗜冷產甲烷古菌，與圖3結果相一致，但仍需進一步分離鑒定目前該工作正在進行。

4 復合菌系應用效果研究

不同復合菌系接種量對累計甲烷產氣量的影響如圖7所示。從圖7可以看出，隨著接種量的增加，累計甲烷產氣量也持續(xù)增加，10%、15%接種量15d累計甲烷產氣量最高分別為211mL、234mL，對照僅為103mL，分別較對照提高100.5%、106%，達到顯著水平(P＜0.05)，多重比較顯示10%、15%處理在整個發(fā)酵周期累計甲烷產氣量變化差異不顯著(P＞0.05)考慮到添加成本問題，10%為最適接種量。

不同酸化液物料濃度對復合菌系沼氣發(fā)酵累計甲烷產氣量的影響如圖8所示。從圖中可以看出，酸化液物料濃度為8%時15d累計甲烷產氣量最大為236mL，4%、16%、20%處理分別為201mL、213mL、207mL，分別較8%處理降低12.3%、11.6%、12.1%達到顯著水平(P＜0.05)，多重比較顯示4%、16%、20%處理整個發(fā)酵周期累計甲烷產氣量變化差異不顯著(P＞0.05)，表明8%為沼氣發(fā)酵過程復合菌系的最佳底物濃度，且增加底物濃度接近干法水平復合菌系仍然可以完成發(fā)酵正常產氣。

四 結論

本實驗通過低溫馴化，以甲烷含量及產氣量為研究指標，選育出一組穩(wěn)定、低溫、高效產甲烷復合菌系。14.0℃時甲烷純度達到63.3%，15d時產氣量139mL。

方差分析溫度對日產氣量及甲烷含量均有顯著性影響，根據(jù)回歸方程計算得到復合菌系的最適產氣溫度為13.0～22.0℃。

產甲烷活性抑制與恢復實驗表明當溫度為14、18、22℃時，表現(xiàn)為促進產甲烷作用；當溫度為6、10℃時，則表現(xiàn)為抑制產甲烷作用。重新置于14±0.5℃進行恢復性培養(yǎng)，原來6、10℃抑制作用消失，而30℃抑制作用保持不變，表明溫度對復合菌系中的關鍵微生物在6、10℃的抑制作用是可恢復性的，而在30℃下則是不可恢復性的，從而推測復合菌系中的微生物多為專性嗜冷產甲烷古菌，尚需進一步分離鑒定目前該工作正在進行。

10%為該復合菌系最適接種量，8%為沼氣發(fā)酵過程復合菌系的最佳底物濃度，且增加底物濃度接近干法水平復合菌系仍然可以完成發(fā)酵正常產氣。

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